表皮葡萄球菌基因敲除及其控孪生物...

残基乙酰化程度较高，另外含有磷酸及琥珀酸，带负电荷（＜２０％）……。

ＰＭ是由Ｍａｃｋ等首先发现并命名的。

他们曾将Ｔｎ９１７转座子转导入产生物膜的表皮葡萄球菌中，得到了ＭＩＯ和Ｍ１ｌ两种生物膜阴性的突变体。

实验显示，ＭＩＯ和Ｍ１１初期粘附到生物材料上的能力正常，而后期细胞问相互粘附能力却大大下降，无法形成生物膜。

分析显示，ＭＩＯ和Ｍ１ｌ就是缺乏特异性的脂多糖抗原一ＰＩＡ，提示ＰＩＡ在介导细胞间相互粘附中是不可缺少的。

ＰＩＡ是由ｉｃａＡＤＢＣ操纵子控制合成的。

图１生物膜形成过程示意图
二．生物膜形成的基因调控
１．ｉｃａＡＤＢＣ基因座位控制ＰＩＡ形成
Ｐｎ合成的基础是ｉｃａ基因嘲。

研究表明，ｉｃａ基因位点包含一个操纵子结构
ｉｃａＡＤＢＣ，是合成ＰＩＡ所需的结构基因。

其中ｉｃａＤ基因位于ｉｃａＡ和ｉｃａＢ基因之间，且与两者有部分重叠。

ＩｅａＡ为４１２个氨基酸组成的跨膜蛋白，ＩｃａＣ为３５５
个氨基酸组成的疏水膜蛋白，ＩｃａＢ为２９８个氨基酸组成，可能为分泌蛋白。

ｃａｒｎｏｓｕｓ体外ＰＩＡ合成实验表明，ＩｃａＡ单独呈现低的Ｎ一乙酰葡糖Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ
胺转移酶活性，ｉｃａＡ和ｉｃａＤ共表达，可使酶活性大大提高，可合成最大链长达２０个残基的寡聚物。

只有当ｉｃａＡ、ｉｃａＤ和ｉｃａＣ协同表达，合成的多聚物才能与ＰＩＡ特异性抗血清反应，还不清楚该多聚物是否为全长ＰＩＡ链还是ＰＩＡ合成的中间体。

此３个基因中任何一个发生突变，生物膜都不能形成。

ＩｅａＢ似乎不直接参与ＰＩＡ合成，因为在ｓ．ｃａｒｌ＇ｌｏ￥１１ｓ中，重组ｉｃａＡＤＣ就能使细胞聚集，说明只此３个基因就可以合成有功能的ＰＩＡ分子“７。

’“。

图２ｉｃａ操纵子结构图
２．ＩｅａＲ阻遏／ｃａＡＤＢＣ基因表达
ｉｃａＲ基因位于ｉｃａＡＤＢＣ操纵子上游，生物信息学分析显示其可能为转录调节因子ｔｅｌＲ家族成员之一，转录方向与ｉｃａＡＤＢＣ相反。

Ｃｏｎｌｏｎ等（２００２年）研究能形成生物膜的野生型表皮葡萄球菌ＣＳＦ４１４９８及其ｅｒｍＢ基因插入突变株ＩＣＡＲｌ，ＩＣＡＲ２，ＩＣＡＲ３ＧｅａＲ：：Ｅｍ。

）发现ｉｅａＲ启动子基因转录在野生型及突变株相差无几。

突变株ｅｒｒａＢ基因插入ｉｃａＲ，不影响ｉｃａＲ从启动子转录，表明ＩｃａＲ蛋白不参与自身转录调节。

但ｉｃａＲ基因插入突变使ｉｃａＡＤＢＣ操纵子转录增加５．８倍以上，互补实验也证明ｉｃａＲ基因编码ｉｃａＡＤＢＣ操纵予阻遏蛋白，调节ｉｃａＡＤＢＣ转录。

进一步研究表明ＩｃａＲ需与其它因子协同才能完全阻遏ｉｃａＡＤＢＣ转录ｏ“…。

３．ＳａｒＡ增强／ｃａＡＤＢＣ基因表达
在金黄色葡萄球菌中，环境因子可通过ｓａｒ和ａｇｒ系统，调节细胞相关基因
得到质粒ｐＢＴＺ∑ｓａｒＡ（含ｓａｒＡｌ：：埘：：ｓａｒＡ２）
◆抽提质粒，电转化至金黄色葡萄球葭ＲＮ４２２０
上抽提质粒，电转化至表皮葡萄球菌ｍ惦２Ａ
４２＂Ｃ培养，四环素平板筛选
上
选出四环素耐药，氯霉素敏感的的表皮葡萄球菌ｓａｒＡ基因缺陷型菌株
上
ＰＣＲ．基因测序方法鉴定表皮葡萄球菌ｓａｒａ缺陷型菌株
围１．１ｓａｒａ缺失茸株的构建
图１．２基因同源重组及其ＰＣＲ检测示意图
２．表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ的ＤＮＡ抽提…１
（１）挑取菌落接种于液体培养基摇床培养过夜（１６ｈ）。

（２）５毫升离心管１３０００转离心３０秒。

２结果
１．ｐＢＴＡｓａｒＡ的构建
用ＰＣＲ方法扩增出片断ｓａｒＡｌ和片断ｓａｒＡ２后，分别用ＰｓｔＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ和ＰｓｔＩ，ＥｃｏＲＩ酶切回收，克隆到质粒ｐＢＴ２上，得到ｐＢＴ２－ｌ。

用瑚Ｉ酶切ｐＢＴ２－１，插入四环素抗性基因ｔｅｔ从而构建成功重组质粒ｐＢＴＡｓａｒＡ。

重组质粒的酶切鉴定见下图。

Ｌａｎｅｌ为ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ酶切质粒ｐＢＴＡｓａｒＡ，所切得的片断分别是ｐＢＴ２－Ｓ１（６９７０＋８３６）ｂｐ，ｔｅｔ１２７６ｂｐ，ｓａｒＡ２８５７ｂｐ：Ｌａｎｅ２为Ａ，Ｉ＇胁栅ＩＩ酶切质粒ｐＢＴ２．１，所得片断分别是ｐＢＴ２一Ｓ２（６９７０＋８５７）ｂｐ，ｓａｒＡｌ８３６ｂｐ：Ｌａｎｅ３为ＥｃｏＲＩ酶切质粒ｐＢＴ△ｓａｒＡ所得片断为ｐＢＴ２一Ｓ２一ｔｅｔ—Ｓ１（６９７０＋８５７＋１２７６＋８３６）ｂｐ。

图２．１质粒ｐＢＴＡｓａｒａ尊切后电泳图
２．质粒ｐＢＴＡｓａｒＡ电转化入金黄色葡萄球菌菌ＲＮ４２２０
构建的重组质粒ｐＢＴＺｌｓａｒＡ电转化入金黄色葡萄球菌进行修饰，然后抽提，并以此为模板做ＰＣＲ。

Ｌａｎｅｌ为以引物Ｔ１和Ｓ１．１ＰＣＲ所得产物应是四环素基因和ｓａｒＡｌ基因相连的基因，大小为（１２７６＋８３６）ｂｐ，Ｌａｎｅ２为引物Ｔｌ和Ｔ２ＰＣＲ所得产物应是ｔｅｔ基因，大小为１２７６ｂｐ。

圈２．２从金黄色葡萄球菌ＲＮ４２２０中的抽得的ｐＢＴ』Ｘｓａｒａ质粒的ＰｃＲ鉴定固
３．表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡｓａｒＡ基因缺失菌株的筛选
３．１ＰＣＲ鉴定
分别以表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡＬｘｓａｒＡ和ＲＰ６２Ａ的染色体ＤＮＡ为模板，以ＴＢ和ＳＡ２为引物进行ＰＣＲ扩增，结果发现以表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡ为模板的扩增出（１５４＋８５７）ｂｐ的片断，而以表皮葡萄球菌ＲＰ６ＺＡ为模板的未见扩增条带。

图２．３以表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡＬＸｓａｒａ和ＲＰ６２Ａ的染色体ＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ扩增后的电泳图
３．２表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ／ｋｓａｒＡ的ｓａｒＡ：：ｔｅｔ基因测序
采用以ＴＢ和ＳＡＰ．为引物以ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡ为模板扩增出的１０００多ｂｐ的片断构建到Ｔ载体上测序，测序结果为正确。

４．表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ６．ｓａｒＡ基因功能性表达
４．１ＲＴ－ＰＣＲ检测表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ和ＲＰ６２ＡＩＸｓａｒＡｍＲＮＡ的转录水平４．１．１ＲＴ－ＰＣＲ检测ｓａｒＡ转录水平
抽提亲本株ＲＰ６２Ａ，突变株ＲＰ６２Ａ△ｓａｒＡ，互补株ＲＰ６２Ａ△ｓａｒＡ（ｐＨＰＳ９ｓａｒＡ）为模板，ＲＴ－ＰＣＲ方法检测ｓａｒＡ基因的ｍＲＮＡ表达水平。

结果发现以突变株为模板的未见ｓａｒＡ条带。

证明表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡＩｘｓａｒＡｍＲＮＡ的转录水平阴性。

以亲本株和互补株为模板的有ｓａｒＡ条带，说明二者表ｓａｒＡ蛋白。

从而在ｍＲＮＡ水平上证明了ｓａｒＡ基因的敲除。

Ｌｓｎｅ１．Ｍａｒｋｅｒ
Ｌａｎｅ２以ＲＰ６２Ａ△ｓａｒＡ为模
板ＲＴ－ＰＣＲ产物
Ｌａｌｌｅ３，４以ＲＰ６２Ａ为模板
ＲＴ－ＰＣＲ产物
Ｌ蚰ｅ５．Ｌａｎｅ２以ＲＩ’６２Ａ△
ｓａｒＡ（ｐＨＰＳ９ｓａｒＡ）为
模板ＲＴ－ＰＣＲ产物
图２．４，ＲＴ＿ＰＣＲ检测∞，＾基因
４．１．２ＲＴ－ＰＣＲ检测／ｃａ操纵子的转录
我们的结果显示，以ｇｙｒＢ基因作为内参，跟出发菌株相比，ｉｃａＡ的转录水平在ｓａｒＡ基因突变株中大大降低（图２．５，ｌａｎｅ２），而在ｓａｒＡ基因互补株中ｉｃａＡ的转录水平又上升了（图２．５，ｌａｎｅｌ）。

这些数据显示，ＳａｒＡ蛋白是ｉｃａ操纵子的正调节因子。

表皮葡萄球菌ｓａｒａ基因敲除及其控制生物膜形成的功能研究
图２．５。

ＲＴ－Ｉ，ｃＩｔ检制ｔｏａ探坝子
Ｌａｎｅ１，ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡ（ｐＨＰＳ９ｓａｒＡ）
Ｌａｎｅ２．ＲＰ６２Ａ△ｓａｒａ
Ｅａｒｌｅ３，ＲＰ６２Ａ
Ｅａｒｌｅ４，Ｍａｋｅｒｓ
４．２试管培养的生物膜形成的现象观察
如图２．６，在试管里加入３ｍＬ左右的ＴＳＢ，摇床３７＂Ｃ，２２０转过夜培养。

能形成生物膜的茵则在试管壁上形成一层白膜，生物膜形成阴性的则没有白膜。

图２．６试管培养的生物膜形成的现象观察１：ＴＳＢ；
２：ＲＰ６ＺＡ；
３：ＲＰ６２ＡＳａｒＡ（ｐｎＰＳ９ｓａｒＡ）４：ｌｉｐ６２ＡｌＸｓａｒＡ：
５：＾ＬＴｃＣｌ２２２８
４．３表皮葡萄球菌生物膜表型鉴定
如图２．７，表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ在刚果红平板上培养了２４ｈ后形成了典型的黑色，粗糙的菌落。

生物膜阴性的对照株表皮葡萄球菌ＡＴＣＣｌ２２２８则形成了红色光滑的菌落。

而ＲＰ６２ＡＺＸｓａｒＡ菌株在刚果红平板上的形态生物膜阴性菌株类似，也是红色，湿润的，它说明了ｓａｒＡ突变型菌株是生物膜阴性的。

而ｓａｒＡ基因突变型的互补株ＲＰ６２Ａ△ｓａｒＡ（ｐＨＰＳ９ｓａｒＡ）在刚果红平板上则表现为黑色、粗糙的形态，表明生物膜的形成能力又回复了。

ＲＰ６２Ａｒ／ｈａｒＡ－Ｃ）：ＲＰ６２ＡＺｈａｒＡ（ｐＨＰＳ９ｓａｒＡ）
图２．７，刚果红平板上的茵落
４．４定量检测生物膜形成
如图２．８所示，表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ在ＴＳＢ培养基上是生物膜形成阳性的，相反，表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡ突变株和表皮葡萄球菌ＡＴＣＣｌ２２２８则不能形成生物膜。

而册．Ａ基因的互补株ＲＰ６２Ａ△阳从０｝ＩＰｓ鲰甜Ａ），生物膜形成能力又得以恢复，它用９６孔板法检测所得的ＯＤ值为０．４７６（＞Ｏ．１２０）。

２７
图２．８９６孔板法定量检测生物膜形成
１：ＡＴＣＣｌ２２２８；２：ＴＳＢ：３：ＲＰ６２Ａ；４：ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡ）５｝ＲＰ６２ＡＺｈａｒＡ（ｐＨＰＳｇｓａｒＡ）
ＡＴＣＣｌ２２２９：生物膜阴性菌株；表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ：生物膜阳性菌株：表皮葡萄球菌ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡｓａｒＡ基因突变株；ＲＰ６２ＡＺｈａｒＡ（ｐＨＰＳ９ｓａｒＡ）］：ｓａｒＡ基因互补株。

５．抗生素药物敏感性的变化
ｓａｒＡ基因突变对于表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ的抗生素抗性有很大的影响。

如图２．９，ｓａｒＡ基因突变型明显对于红霉素和卡那霉素的敏感性大大提高了。

在红霉素浓度为２００Ｊｔｇ／ｍＬ时，ＲＰ６２ＡＡｓａｒＡ就不能生长了，而它的野生菌株ＲＰ６２Ａ要求红霉素浓度达到８００ｐｇ／ｍＬ才能起到抑制的作用（图２．９，Ｂ）。

ＲＰ６２Ａ在卡那霉素０－－８００¨ｇ／ｍＬ这个浓度范围内生长基本上不受任何抑制，而ｓａｒａ基因缺陷菌株在２００弘ｇ／ｍＬ时ＯＤ值就明显下降（图２．９，Ａ）。

说明了ｓａｒＡ基因突变会对表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ的抗性产生很大影响。

图２．９表皮葡萄球菌ＲＰ６２Ａ和ｓａｒａ基因缺陷株ＲＰ６２Ａ△ｓａｒａ对两种抗生素的抗性变化。

Ｋ：ｓａｒａ基因缺失株，ｗ：亲本株。

表皮葡萄球菌sarA基因敲除及其控制生物膜形成的功能研究
作者：陶菊红
学位授予单位：复旦大学
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