基因芯片在肺癌研究中的应用

·２０国外医学呼嗷系统分册２００２年第２２卷第１期
基因芯片在肺癌研究中的应用
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日东南大学附属中大医院呼吸科（南京２１０００９）邹春芳综述张祖贻审校摘要基因芯片在肺癌研究中用于检测癌组织与正常组织基因表达的差异、肺癌基因表达谱，癌基因产生
突变的检测确定，测序分薪，癌细胞耐药基因的检测等。

关ｔ词基因芯片；肺癌
怖癌在所有的癌症中间是致死的主要原因，人们现在注目的焦点是研究肺癌发生的分子事件，从而指导诊断和治疗。

用于这方面研究的分子遗传学方法很多，如ＰＣＲ法、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交、ｍＲＮＡ差异显示、ｃＤＮＡ代表性差异分析、比较基因组杂交等。

虽然这些方法有助于我们理解肺癌的发病机制，有助于提高诊断和治疗水平。

但是它们各自有不同的缺撼。

而基因芯片能够克服它们的缺点，在包括肺癌在内肿瘤研究中应用较多。

ｌ基因芯片概述
基因芯片（又称ＤＮＡ芯片、ＤＮＡ阵列、ＤＮＡ微阵列、寡核苷酸阵列、微阵列或芯片等）属生物芯片的一种，以小的固体支持物（一般为１平方厘米左右的显微镜载玻片或硅片）上有成千上万个ｃＤＮＡ，１ＤＮＡ或寡核苷酸以阵列的形式排列，代表可知的基因或Ｅ盯（表达序列标签）克隆或一个基因完全的突变序列，荧光标记从组织中提取的ＤＮＡ或ＲＮＡ并制备成探针与芯片杂交，反应结果用同位素法、化学发光法和酶标法显示，然后用精密的扫描仪和ＣＣＤ摄像技术记录，计算机系统分析处理所获信息¨’３一。

芯片技术因具有快速、高效、高通量、高度并行性及高度敏感性、自动化程度高等特点，自发展伊始，已广泛应用于生命科学的各个领域，并已用于基因功能各个方面的研究：如基因差异表达的检测、基因表达谱的分析、测序分析、基因分型、遗传作图、基因突变、疾病诊断、药物筛选，以及新基因寻找等，同时在微生物菌种鉴定及致病机制中发挥作用。

作为分子遗传学研究方法之一的基因芯片相对于其它方法有许多优点，因为Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交只适用于检澍高丰度的基因，且敏感性不高；ＲＴ．ＰＣＲ所能检测的表达基因数量较少；ｍＲＮＡ差异显示法假阳性较高，且难于定量；出ＮＡ代表性差异分析对点突变、小的缺失或插入引起的差异表达难以检测；比校基因组杂交（ＣＧＨ）仅能检测所有待测标本的ＤＮＡ平均拷贝散变化，多克隆的肿瘤彼此之间某些区域拷贝教变化可能会相互平衡而致ＣＧＨ检测不出，不能检测插入及易位等。

而基因芯片克服了以上缺点．越来越受到人们的关注，尤其在肿瘤研究方面渐趋增多。

主要用于比较癌组织与正常组织基因表达的差异，癌基因产生突变的检测确定，抑癌基因的缺乏和变异．癌细胞多药耐药基因的研究等。

有较普遍意义的Ｐ５３，Ｒａｓ，Ｒｂ等基因均已制成芯片，可供直接使用。

应用最多的要属Ｐ５３基因芯片，其是把Ｐ５３基因的全部序列和已知的突变探针集成在芯片上而制成的；还有一种叫基因表达谱芯片，其在肿瘤中应用较广。

它是将成千上万个基因特异的探针固定在一块芯片上，对来源不同的个体、组织、病变等细胞内的ｍＲＮＡ或逆转录产物ｅＤＮＡ进行检测，从而大规模对这些基因表达的个体特异性、病变特异性、组织特异性进行分析和判断。

基因芯片已用于许多肿瘤的研究，如前列腺癌【４ｊ、鼻咽癌∞Ｊ、黑色素瘤【６Ｊ６、乳腺癌【…、横纹肌肉瘤㈦等。

２，基因芯片在肺癌研究中的应用
２．１用于基因表达谱或基因差异表达的检测，并可以发现新基因Ｈｅｌｌｍｅｎｎ等”ｏ利用ｃＤＮＡ阵列法鉴别培养的人肺支气管上皮和肺癌细胞系共６００个基因表达谱的差异。

相对于正常人肺支气管上皮，４个肺癌细胞系皆可发现１７个基因差异表达，包括ＭＲＰ８和ＭＲＰｌ４下调、ＣＹＰｌＢｌ上调。

ｚｈａ０等【ｌ驯利用ｃＤＮＡ表达阵列法进行石棉诱导的人类支气管上皮的致瘤差异表达基因的检测。

检测到１５个。

而其中１１个可通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹证实。

得出结论：胰岛素受体通路的激活和ＤＣＣ（ｄｅｌｅｔｅｄｉｎｃｏｌｏｎ）、Ｋｕ７０的失活共同参与石棉诱导的人肺支气管上皮恶行转化。

何志巍等Ｌ“Ｊ为研究鼻烟与鼻咽癌及肺癌基因表达谱差异，采用ａ一３２Ｐ逆转录标记组织总ＲＮＡ，将ｅＤＮＡ探针与有５１８４个基因或表达序列标签（ＥＳＴ）的高密度徽阵列ＧＦ２００杂交，软件分析表达谱差异。

结果发现三者呈低水平为主的表达谱。

密度值在２００以上的基因或ＥＳＴ在鼻咽癌１１０个，肺癌１３４个，鼻咽正常组织１５８个。

说明鼻咽、鼻咽
　万方数据
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癌、肺癌之间存在基因表达的差异；证实ｅＤＮＡ微阵列法是一种筛选差异表达基因的快速有效方法。

ｅＤＮＡ微阵列技术显然使许多基因同时表达成为可能，但这种方法不足之处在于带有充分信息的基因将主导排成阵列的相应ｅＤＮＡ，抑制基因低水平表达的出现。

为增加肺癌中即能识别充分表达的信息又能识别相对不充分表达信息的潜能，Ｗａｎｇ等１１２Ｊ利用ｅＤＮＡ消减和ｅＤＮＡ微阵列相结合的方法来鉴定肺鳞状细胞癌中差异过表达基因。

结果发现１７个基因差异表达，包括４个新发现基因。

同时’鉴定出组织特异性基因、肿瘤特异性基因等。

这两种方法相结合提出了一个高效能方法来鉴定肿瘤特定基因。

这些基因特征性报道将有助于发掘它们诊断、预后、治疗的潜能。

２．２Ｐ５３基因芯片测定进行Ｐ５３基因突变的检测和测序分析Ｐ５３抑癌基因是人类癌症中最频发突变的基因，且Ｐ５３基因突变和预后不良相差。

在人类许多癌症中也提出了Ｐ５３一个新的作用：即其与肿瘤对化疗和放疗的反应相关联＿１…。

快速准确鉴定临床样品中Ｐ５３突变序列，有助于获得有用信息，对于癌症患者的诊断ｊ分期和管理等方面有助益。

Ｐ５３基因芯片测定的开发和应用对于Ｐ５３突变检测和序列分析意义重大。

Ｓｏｎｇ等【１４ｏ利用Ｐ５３特定ｅＤＮＡ阵列技术对比了人类肺癌细胞系控制细胞周期检验点和细胞凋亡的３０个基因的表达。

２２个已经显示表达增加，这其中２个基因Ｃ－ａｄｄ４５和ＰＩＧ２表达增加达１０倍之多。

Ａｈｒｅｎｄｔ等【”Ｊ在１００个原发的人类肺癌中利用双脱氧二核苷周期测序方法和Ｐ５３基因芯片测定方法来进行Ｐ５３基因突变序列的测定。

双脱氧二核苷周期测序可以检测Ｐ５３基因（外显子５—９）保守区域突变的７６％；Ｐ５３基因芯片可测定所有突变的８１％（外显子２—１１），包括基因保守区域突变舳％。

基因芯片可以测定５２个错义突变中的４６个，比直接测序要敏感得多，并且基因芯片可以节省大量时间。

１００个样品１个调查者６个星期即能完成；可直接测序要花去１年时间。

同时基因芯片特异性９８％。

比直接测序１００％仅相差２％。

流行病证据提示肺癌大多数病例直接和吸烟相关。

和非吸烟患者相比，吸烟者有１０倍的危险死于肺癌【”】。

而分子流行病研究也开始把特定的环境、致癌剂和肿瘤进展的突变事件相关联ｕ”。

故许多研究表明吸烟相关肺癌Ｐ５３突变谱和非吸烟相关肿瘤有显著的不同。

尽管重度饮酒增加肺癌危险
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性，但吸烟和乙醇的摄取对于肿瘤Ｐ５３基因突变频率的影响还不清楚。

Ａｈｒｅｎｄｔ等【１８－选用１０５个非小细胞癌患者标本，利用直接周期测序和Ｐ５３基因芯片测定来对这方面进行研究。

得出结论：吸烟和饮酒都与非小细胞癌患者Ｐ５３基因突变相关。

酒精
或许增加吸烟对于非小细胞肺癌Ｐ５３基因突变的ｔ
可能性。

２．３用于基因功能的检测柴油排气（ＤＥ）颗粒中有各种各样的致癌源和致突变源。

实验动物长期暴露于ＤＥ装置前可诱导肺癌。

Ｓａｔｏ等”…利用Ｆ３４４鼠暴露于ＤＥ前４星期，含有ＤＥ颗粒６ｍｇ／甜。

利用ｅＤＮＡ微阵列方法发现Ａ－ｒａｆ和ＰＣＮＡ（增殖细胞核抗原）ｍＲＮＡ在暴露ＤＥ的鼠肺中得到诱导。

通过Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹证实。

指出：Ａ—ｒａｆ和ＰＣＮＡ有助于鼠肺致癌作用。

ＰＴＥＮ是一个肿瘤抑癌基因，与酪氨酸磷酸酯酶和细胞骨架蛋白ｔｅｎｓｉｎ、ａｕｘｉｌｉｎ序列同源。

最近Ｔａｍｔｔｒａ等１２０Ｊ已经证实ＰＴＥＮ能够调节复杂通路，抑制细胞迁移和播散，以及病灶粘连形成。

Ｐ１飞Ｎ
能维持细胞对凋亡的敏感性。

Ｈｏｎｇ等－２ｕ在肺腺癌中研究即ＥＮ在癌侵袭中的作用。

构建了结构组成和可诱导野生型ＰＴＥＮ过表达的转染体。

利用ｅＤＮＡ微阵列检测表达谱变化。

ＰＴＥＮ可上调和下调某些基因。

从而得出结论：ＰＴＥＮ过表达可以抑制肿瘤侵袭。

此方法可以研究肿瘤抑制基因下游基因的功能。

视黄醛受体（ＲＡＲｓ）是维甲酸多重效应的调节因子，而视黄醛受体＆（ＲＡＲｂｅｔａ２）是维甲酸增长和肿瘤抑制效应的主要调节因子。

这个基因在许多上皮细胞肿瘤和上皮细胞肿瘤来源的细胞系是失活的。

Ｔ（刈ｏｕＳｅ等【２２Ｊ利用ＡｔｌａｓＨｕｔｎａｎｅＤＮＡ阵列Ｉ，用ＲＡＲｂｅｔａ２转染不能正常表达’ＲＡＲｂｅｔａ的肺肿瘤源的细胞系ｔａｂｕ－１，并由此鉴定出由其直接或问接调节的２７个基因下调表达等。

从而支持假设：在ＲＡＲｂｅｔａ缺乏的肿瘤细胞中这些基因的下调表达有助于免疫系统的逃避。

由此提出了一个治疗肿瘤的新方法。

２．４在肿瘤耐药和药物作用机制方面的研究恶性肿瘤对化疗药物疗效作用具有抗性称为耐药。

目前肿瘤细胞对药物耐药已成为导致恶性肿瘤化疗失败的关键。

抗肿瘤药物ＮＢ－５０６和Ｊ－１０７０８８是强有力的拓扑异构酶抑制因子。

为了澄清参与这两种药物耐药的因子，Ｋｏｍａｔａｎｉ等【２３』建立了喇个鼠成纤维细胞系（ＬＹ／ＮＲｌ和ＬＹ／ＮＲ２），一个人类结肠癌细胞系（ＨＣＴｌｌ６／ＮＲｌ）和一个肺癌细胞系（ＰＣＩ３／
　万方数据
ＮＲｌ）。

通过寡核苷酸微阵列对３４０２０个基因进行分析。

发现一个ＡＴＰ结合盒输送器ＢＣＲＰ（乳癌耐药蛋白）／ＭＸＲ／ＡＢＣＰ／（ＢＣＲＰ）在ＬＹ／ＮＲ２中高表达，高于亲代细胞３１倍。

这种结果在两个人类耐药细胞系中也可以检测出。

经ＢＣｌ冲表达载体转染的Ｐｃｌ３细胞系显示分别２２倍和１７倍耐药于ＮＢ５０６和ｆ—ｍ７０８８。

大多数抗肿瘤药物导致ＤＮＡ丝条断裂，最后导致细胞周期停止或细胞死亡。

Ｄａｎ等【２４３利用ｅＤＮＡ阵列法鉴别出经阿霉素治疗的肺癌细胞系Ａ５４９导致Ｇ２停止的上调和下调基因，发现细胞周期蛋白Ｂ１减少。

经足叶乙甙和依立替康治疗的细胞系也发现有（３２停止和细胞周期蛋白Ｂ１减少。

２．５在恶性肿瘤肺转移中的应用恶性肿瘤转移一直是个很显著并很棘手的问题，是癌症患者主要的死亡原因。

Ｋｈａｎｎａ等１２５３利用ｃＤＮＡ微阵列，用骨肉瘤鼠模型来解释肺转移的遗传决定簇。

微阵列分析并解释了５３个基因（３１６６个独立的ｃＤＹＡ）在侵袭性较强和侵袭性较弱的鼠骨肉瘤模型中有差异表达。

２．６‘用与多态性分析和基因分型人类癌症的发生由于散发突变和染色体改变联合所致。

Ｌｉｎｄｂｌａｄ—Ｔｏｈ等Ⅲｊ对于杂合性缺失（ＬＯＨ）的大量单核苷酸多态性（ＳＮＰ）进行基因分型。

通过高密度阵列法。

特异性得到人类小细胞肺癌和对照组ＤＮＡ样品杂交的ＬＯＨ分析结果。

这个结果阐述了ＳＮＰ阵列杂交对于肿瘤研究的作用。

２．７其它基因芯片又称微阵列。

而微阵列包括ｅＤＮＡ微阵列、寡核苷酸徽阵列和组织微阵列。

许多不同的肿瘤基因扩增是非常普遍的，此方面的研究可以给肿瘤的诊断、预后和治疗提供有用的信息。

Ｓｃｈｒａｍｌ等（驯利用组织徽阵列技术对１７种不同类型的肿瘤进行基因扩增的调查。

把３９７个各自独立的肿瘤标本以阵列的形式排在一个单一的石腊切片上。

三个广泛研究的基因（ＯＣＮＤｌ、ＭＹＣ、ＥＲＢ】翌）在肺癌中均发厦有扩增，而其它肿瘤如前列腺癌、结肠癌等也发现扩增。

这个实验展示了利用微小阵列组织标本进行肿瘤筛选的方法。

３结语与晨誓
肺癌是危害人们生命健康的一大顽症之一，至
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今没有找到根治的办法。

原因是人们对肺癌的发病机制不很清楚，而且目前多药耐药常常导致化疗失败等。

基因芯片技术的出现对肺癌发病的分子事件有了更深一层的了解，而且对包括肺癌在内的恶性肿瘤出现多药耐药的机理将有进一步理解等，对恶行肿瘤的诊断治疗及预后等意义重大。

其它分子遗传学方法在不断改进的基础上仍有着应用的空间，基因芯片与它们互补应用必将焕发无穷的魅力。

但是不可否认到目前为止我们虽然能发现很多肺癌差异表达基因，但还不能找到诊断肺癌的特异基因，毕竟肺癌的病理分型很多，如小细胞肺癌、非小细胞肺癌等。

而同时基因芯片技术在我国刚剐起步，有许多期待完善的地方，且此技术价格较昂贵等。

有不足更有希望，在科学技术突飞猛进的今天，基因芯片技术必将越来趣完善，必将对医学作出更大的贡献。

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