金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳实验步骤

金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳实验步骤
提前准备
从检测培养基上挑取单菌落，接种于含5%去纤维蛋白羊血的哥伦比亚琼脂平板（或相当的培养基）上培养，37℃孵育箱培养16-20小时。

同时接种标准株H9812。

第一天
步骤1 细菌的包埋
1、打开水浴摇床（54℃）、水浴箱（56℃）。

2、用TE缓冲液（具体试剂配制方法见附件）制备1%Seakem Gold：1%SDS琼脂糖，以配制25ml体积为例说明，方法如下：
(1)准确称取0.25g SeaKem Gold agarose, 放入250ml的蓝色瓶内。

(2)加入25ml TE缓冲液，轻柔摇荡瓶子使琼脂均匀散开。

(3)微松瓶盖，将玻璃瓶放于微波炉内高火加热30秒，取出轻柔摇荡，再次
加热30秒，重复操作直至琼脂彻底溶解（无颗粒物、悬浮物，透光均一，无明显异常折光，无气泡）。

(4)将溶解的SeaKem Gold agarose放入56℃水浴箱内备用。

3、在Falcon 2054管（或其他相当的管）上标记样品名称和空白对照；在1.5ml 微量离心管上标记好对应样品的名称。

4、在Falcon 2054管中分别加入约2ml细胞悬浊液TE（配制方法见附件）。

注：使用测定细菌浓度的容器不同加入TE的量也不同。

5、从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于TE中。

调整细胞悬液浓度至指定范围。

用eppendorf分光光度计在600nm波长测其OD值，调整至5.5～6.5之间。

6、取400µl细菌悬浊液于相应的1.5ml微量离心管中，置于37℃水浴中孵育5分钟。

将剩余的细菌悬浊液置于冰上直到胶块制备完毕。

7、从水浴箱中取出微量离心管，每管加入3µl溶葡萄球菌酶（储存液浓度1mg/ml）混匀。

8、加入400µl的1%Seakem Gold到上述装有400µl细菌悬液的微量离心管内，用枪头轻轻混匀，避免有气泡产生。

（此时1%Seakem Gold需置于56℃水浴中）
注：没有用完的Seakem Gold agarose可放于室温，并可重复使用1-2次。

再溶时，加热时间缩短到每10-15秒一次，直至完全溶解。

9、迅速将混合物加入模具，避免气泡产生，在室温下凝固10-15分钟。

为节省时间也可以在4℃下凝固5分钟。

10、记录好模具内对应样品的名称。

步骤2 细菌的裂解
1、在50ml离心管上做好样品标记。

注：相同菌株的胶条可以同时放于同一个管中裂解，最多不要超过4条。

2、配制细胞裂解液CLB （配制方法见附件），然后向每5ml细胞裂解液加入25µl 蛋白酶 K（20mg/ml），使其终浓度为0.1mg/ml，然后颠倒混匀。

注：蛋白酶K要置于冰上，配制好的蛋白酶K/CLB混合液也要置于冰上。

建议配制总量后进行分装。

3、每个离心管加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。

4、如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。

打开可重复利用模具，用小铲将胶块推入上述裂解混合液中。

保证胶块在液面下，而不在管壁上。

注：剩余的菌液以及其它使用过的器具应丢弃并消毒。

可重复利用模具需要浸于泡腾片消毒液中15分钟，然后清洗干净。

5、将离心管放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约130转/分钟。

确认水浴箱内液面高于离心管内裂解混合液的液面。

6、将纯水和TE放在50℃水浴箱中预热。

步骤3 清洗胶块
1、调低水浴摇床的温度至50℃。

2、从水浴摇床中拿出装有胶条的离心管，盖上滤盖，轻轻倒掉CLB，在实验台上轻磕管底使胶块落在管底。

注：可将离心管倒置在吸水纸上，使管内液体被尽量排净。

随后的操作中也如此。

3、每管中加入10ml预热的TYPE ONE WATER。

确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。

注：TYPE ONE WATER是水质达到18.2M欧的纯水经高压灭菌后得到的，清洗胶块以及配置TE缓冲液时均需使用TYPE ONE WATER。

4、放回50℃水浴摇床中，转速约130转/分钟，摇 10分钟。

5、倒掉水，用TYPE ONE WATER再洗一次。

6、倒掉水，加入10ml预热的TE，在50℃的水浴摇床中摇15分钟。

7、倒掉TE，用TE重复洗三次，每次10－15分钟。

8、倒掉TE，加入10ml TE，放在4℃冰箱保存备用。

注：要确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上。

第二天
步骤4 胶块内DNA的酶切
1、在1.5ml离心管上标记好相应的样品及H9812的名称。

注：H9812为国际标准株，其Xba I酶切片断可用于分子量标准
2、按照下面的比例配制缓冲体系，并混匀。

配制Sma I的稀释缓冲液体系（金黄色葡萄球菌使用Sma I进行酶切）。

注：缓冲液要置于冰上。

不同试剂供应商，相同试剂供应商的不同酶切缓冲液是不通用的，所以应根据产品说明来配制缓冲体系，这里以TaKaRa为例。

3、在每个1.5ml微量离心管中加入200µl缓冲液。

4、小心地从TE中取出胶块放在干净的培养皿上。

5、用刀片切下约2mm宽的胶块放入1.5ml微量离心管中。

确保胶块在液面下面。

将剩余的胶块放回原来的TE中。

6、将试管放在37℃水浴中孵育10-15分钟。

7、在用稀释缓冲液孵育的过程中，以Xbal I为例按照以下比例配制酶切反应体系，混匀。

配制Sma I的稀释缓冲液体系（金黄色葡萄球菌使用Sma I进行酶切）。

注：将酶置于冰上，用后立即放在－20℃保存。

8、用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。

9、每管加入200µl混合液，轻轻在实验台上磕管子的底部，确保胶块在液面的下面。

10、在37℃水浴中孵育3-4小时。

步骤5 加样
1、打开水浴箱，温度调至55-60℃。

2、配制2200ml的0.5×TBE。

3、用0.5×TBE配制1%SeaKem Gold(SKG)胶。

14cm宽电泳胶框（10加样孔）：1.0gSKG胶溶于100ml0.5×TBE中；
21cm宽电泳胶框（15加样孔）：1.5gSKG胶溶于150ml0.5×TBE中。

4、熔化时，微波加热60秒，混合；每隔15-30秒重复一次，直到胶完全熔化。

放在55-60℃水浴箱备用（温度至少平衡30分钟以后使用）。

5、调整梳子高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。

用水平仪调整胶槽使其水平。

6、从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。

7、用枪头吸出酶切混合液，避免损伤或吸出胶块。

8、每管加入200µl 0.5×TBE，室温平衡3分钟。

9、把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。

把标准菌株H9812上样在第1、 5、10个齿上（10齿梳子）或第1、5、10、15个齿上（15齿梳子）。

10、用吸水纸的边缘吸去胶块附近多余的液体，在室温下风干约3分钟。

11、把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。

从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在55℃－60℃平衡的1％SKG。

避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。

在室温下凝固30分钟。

10、记录加样顺序。

步骤6 电泳
1、确保电泳槽是水平的。

如果不水平，调整槽底部的旋钮。

注：不要触碰电极。

2、加入2-2.2L 0.5×TBE,关上盖子。

3、打开主机和泵的开关，确保泵设在－70（这时缓冲液的流速约1L/分钟）和缓冲液在管道中正常循环。

4、打开冷凝机，确保预设温度在14℃（缓冲液达到该温度通常约需要20分钟）。

5、打开胶槽的旋钮，取出凝固好的胶，用吸水纸清除胶四周和底面多余的胶，小心的把胶放入电泳槽，关上盖子。

6、设置电泳参数。

大、小胶均用此参数。

Initial switch time = 4.0 seconds；Final switch time = 40.0 seconds
14cm宽×13cm长的胶，电泳时间为19小时
记录电泳初始电流（通常110－170mA）。

注：以上所推荐电泳时间是以CDC仪器和试剂确定的。

在不同实验室，电泳时间可能不同；调整电泳时间，使电泳胶中H9812最小片段距胶底端1.0-1.5厘米。

第三天
步骤7 图像的获取
1、结束电泳：关机顺序为：冷凝机－泵－主机。

2、取出胶，放在盛放染剂溶液的托盘内。

3、将托盘放在摇床上摇25-30分钟。

4、放掉电泳槽中的TBE，用2L纯水清洗电泳槽，并倒掉液体。

5、戴上手套将用后的染液小心倒入做有标记的棕色瓶中，在托盘中加入400-500ml纯水，放在摇床上脱色60-90分钟，如可能每20-30分钟换一次纯水。

（脱色步骤可选）
6、用成像仪拍摄图像，具体方法参见技术手册，同其它病原菌。