二氯化钴对NaCl胁迫下甘草幼苗叶片活性氧水平及抗氧化酶活性的影响

二氯化钴对NaCl胁迫下甘草幼苗叶片活性氧水平及抗氧化酶
活性的影响
李真;孙业民;李朝周
【摘要】[目的]研究二氯化钴(CoCl2)对NaCl胁迫下甘草幼苗叶片活性氧水平、抗氧化酶活性及脂质过氧化程度的影响.[方法]抗氧化相关酶的活性测定.[结果]在80 mmol/L NaCl胁迫下,随胁迫时间延长甘草幼苗叶片抗氧化酶活性、活性氧水平发生显著变化且脂质过氧化程度逐步加重.在NaCl胁迫前期,幼苗叶片细胞内除过氧化物酶外,超氧化物歧化酶、过氧化氢酶及抗坏血酸过氧化物酶活性显著升高,而活性氧水平和脂质过氧化程度无显著变化.随着胁迫时间的延长,即当80 mmol/L NaCl胁迫延长至30～ 35 d时,活性氧水平与脂质过氧化程度的显著提高;在80 mmol/L NaCl溶液中加入40 μmol/L CoCl2,在胁迫的整个过程中相对提高抗氧化酶的活性,在胁迫延长至30～ 35 d时显著抑制脂质过氧化水平的上升.[结论]40 μmol/L CoCl2可以相对提高80 mmol/L NaCl胁迫后期(30～35 d)甘草幼苗叶片抗氧化酶的活性,并显著抑制活性氧的产生和脂质过氧化的程度.
【期刊名称】《新疆农业科学》
【年(卷),期】2014(051)006
【总页数】5页(P1149-1153)
【关键词】二氯化钴;NaCl盐胁迫;甘草;活性氧;抗氧化酶
【作者】李真;孙业民;李朝周
【作者单位】中国药科大学生命科学技术学院,南京210009;甘肃农业大学生命科学技术学院,兰州730070;甘肃农业大学生命科学技术学院,兰州730070
【正文语种】中文
【中图分类】S567.7+1
0 引言
【研究意义】甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)是重要的中药原料，在我国干旱半干旱区广泛种植，探究盐胁迫对甘草的伤害机制与保护措施具有一定的理论与实用价值。

【前人研究进展】逆境条件下植物体内活性氧代谢系统的平衡会受到影响，当活性氧水平升高到一定程度能启动膜脂过氧化，从而破坏膜结构，严重时导致植物个体死亡[1]。

植物自身靠酶促及非酶促保护系统来清除过剩的活性氧，以减轻逆境胁迫带来的危害。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)及过氧化氢酶(CAT)是酶促保护系统的主要成员，消除细胞内因胁迫诱导产生的过量活性氧、自由基，从而保护细胞膜、酶、核酸等免受活性氧的攻击，对提高植物的抗性起着积极作用[2-4]。

钴是广泛存在于土壤及地壳的一种微量元素，通常被认为是植物的有益元素。

钴还是生物体内维生素B12的重要组成成分，参与豆科植物根瘤菌的固氮作用[5-6]。

适宜浓度范围的钴对植物种子萌发、幼苗生长具有一定的促进作用[7-8]。

前期研究证明，钴有可能通过调节活性氧和乙烯的代谢而发挥其生理作用[9]。

【本研究切入点】钴是乙烯合成的一种重要酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸氧化酶)的抑制剂, 通过抑制该酶的活性,可显著抑制乙烯的产生[10],并由此对盐胁迫下细胞膜的伤害程度及保护系统产生重要影响。

研究以甘草幼苗作为材料, 探讨CoCl2对NaCl不同程度胁迫下甘草幼苗叶片抗氧化酶活性及活性氧水平的影响。

【拟解决的关键问题】采用80 mmol/L NaCl及含40 μmol/L CoCl2的80
mmol/L NaCl浇灌甘草幼苗，研究不同胁迫阶段甘草幼苗叶片抗氧化酶活性及活性氧水平的变化规律。

1 材料与方法
1.1 材料
将甘草种子用自来水冲洗干净后，播种于装有蛭石的塑料花盆中，并置于光强
200 μmol/(m2.s)、光周期16 h光照/8 h黑暗、25℃的人工气候箱中，相对湿度保持在70%左右催芽。

在种子发芽后第2 d开始浇灌适量的1/2 Hoagland营养
液(每2 d浇一次)，至第10 d将幼苗分成两组，分别浇灌加入1/2 强度的Hoagland营养液(含80 mmol/ L NaCl)、含40 μmol/L CoCl2 1/2强度的Hoagland营养液(含80 mmol /L NaCl)，每2 d浇灌一次。

并在分组前及分组后的第5、10、15、20、25、30和35 d，从茎基部取功能叶片进行各指标测定。

1.2 方法
1.2.1 抗氧化相关酶的提取及活性测定
酶提取的整个过程均在0～4℃下进行。

取0.5 g的叶片按1∶3(叶片鲜重∶提取液体积)加入提取液[100 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 7.5)，含1 mmol/L EDTA, 3 mmol/L DTT和5% (w/v)不溶性的聚乙烯吡咯烷醇PVPP]，冰浴研磨匀浆。

匀浆液在15 000×g离心20 min,上清液即可用于酶活性的测定。

SOD活性按照Spychalla,Desborbough的方法进行测定[11]，抑制氮蓝四唑(NBT)光化还原50%的酶量为一个活性单位;CAT、POD和APX活性的测定按照Lin等[12]方法。

1.2.2 TBARS含量测定
参照Dhinsa,Matowe方法[13]。

1.2.3 H2O2和的产生速率
参照Manuel等[2] 和Li等[14]的方法。

1.3 数据统计
每实验重复3～5次，每次测定4～5个样品。

数据采用SPSS统计分析软件进行显著度分析，取P<0.05为显著相关，各数据用平均值±标准差表示。

2 结果与分析
2.1 CoCl2对80 mmol/L NaCl胁迫下甘草幼苗叶片TBARS含量的影响
NaCl胁迫5 d和10 d，甘草幼苗叶片TBARS含量无显著变化；胁迫时间延长到15 d及以后，TBARS含量显著增加。

在整个胁迫进程中(除5 d外)，40 μmol/L CoCl2处理组甘草幼苗叶片TBARS含量增加的幅度均低于对照组 (P<0.05)。

图1
图1 40 μmol/L CoCl2对80 mmol/L NaCl胁迫下甘草幼苗叶片TBARS含量的影响Fig.1 Influences of 40 μmol/L CoCl2 on TBARS content in Glycyrrhiza uralensis seedling leaves under 80 mmol/L NaCl stress
2.2 CoCl2对80 mmol/L NaCl胁迫下甘草幼苗叶片H2O2和产生速率的影响
在80 mmol/L NaCl胁迫的5 d和10 d时，甘草幼苗叶片H2O2 和的产生速率仅有不显著的升高。

15 d后，H2O2 和的产生速率大幅度升高。

添加40 μmol/L CoCl2没有改变80 mmol/L NaCl胁迫过程中H2O2 和的产生速率的变化趋势，但在胁迫的30～35 d，CoCl2显著抑制了H2O2和产生速率的提高。

图2
图2 40μmol/L CoCl2对NaCl胁迫下甘草幼苗叶片H2O2和产生速率的影响Fig.2 Influences of 40 μmol/L CoCl2 on the production rate of reactive oxygen species in Glycyrrhiza uralensis seedling leaves under NaCl stress 2.3 CoCl2对80 mmol/LNaCl胁迫下甘草幼苗叶片抗氧化酶活力的影响
NaCl胁迫开始5 d时，CoCl2 处理组与对照组甘草幼苗叶片SOD、CAT和APX 三种抗氧化酶活性均呈现大幅度升高，胁迫10和15 d时SOD、CAT和APX三种抗氧化酶活性升高幅度减缓，盐胁迫15 d后开始下降，25 d后呈显著下降的趋
势。

POD的活性在NaCl胁迫的0～15 d有不显著地升高，15～25 d略有下降，30 d后显著下降。

CoCl2在NaCl胁迫整个过程中从整体上大幅度提高了SOD、CAT、APX和POD四种抗氧化酶活性。

图3
图3 40 μmol/L CoCl2对NaCl胁迫下甘草幼苗叶片抗氧化酶活力的影响Fig.3 Influences of 40 μmol/L CoCl2 on the activities of SOD, CAT, APX and POD in Glycyrrhiza uralensis seedling leaves under NaCl stress
3 讨论
植物体内活性氧含量的升高能启动膜脂过氧化，从而破坏膜结构；而植物体内自由基大量产生会引发膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统破坏，并在严重时导致植物细胞死亡[8]。

随着80 mmol/L NaCl盐胁迫程度时间的延长，H2O2 和产生速率加快；时间越长，H2O2 和产生速率越快。

植物体内自身的酶促和非酶促抗氧化系统，活性氧一般处于可控的范围内，研究显示在用80 mmol/L NaCl溶液浇灌甘草幼苗的早期甘草幼苗叶片的抗氧化酶活性有大幅度升高，这对于清除活性氧具有重要作用。

而在80 mmol/L NaCl溶液中加入40 μmol/L CoCl2，在胁迫的整个过程中相对提高抗氧化酶的活性(图3)，特别是在胁迫延长至30～35 d时显著抑制脂质过氧化水平的上升(图2)，这与脂质过氧化产物累积的量是一致的，即在80 mmol/L NaCl溶液中加入40 μmol/L CoCl2，在胁迫后期显著抑制了脂质过氧化产物含量的增加。

可以认为40 μmol/L CoCl2可以通过相对提高NaCl胁迫后期甘草幼苗叶片抗氧化酶的活性，显著抑制活性氧的产生及脂质过氧化的程度。

4 结论
NaCl胁迫下，随胁迫时间延长甘草幼苗叶片抗氧化酶活性、活性氧水平发生显著变化且脂质过氧化程度逐步加重；施加CoCl2可以相对提高NaCl胁迫后期甘草幼苗叶片抗氧化酶的活性，显著抑制活性氧的产生和脂质过氧化的程度。

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