急性肝衰竭大鼠肝组织组蛋白去乙酰化酶2的表达

急性肝衰竭大鼠肝组织组蛋白去乙酰化酶2的表达
李汛;何灿明;王鲁文;龚作炯
【摘要】目的观察D-氨基半乳糖盐酸盐诱导急性肝衰竭模型大鼠在丙酮酸乙酯保护下,组蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)的表达情况.方法将78只雄性Wistar大鼠随机分成正常组、模型组、EP干预组和EP治疗组.采用免疫组织化学法检测肝组织HDAC2表达;采用ELISA法检测肝组织匀浆HDAC2水平.结果与正常组比,模型组HDAC2的表达量减少(P<0.05),其中造模12h和24h肝组织HDAC2表达的IOD/Area值分别为0.0817±0.0118和0.0726±0.0111,明显低于正常组
(0.1125±0.0047,P<0.01);EP干预组和治疗组与模型组间HDAC2的表达无明显差异(JP>0.05).结论 EP虽然对肝脏有保护作用,但不能影响HDAC2的表达.HDAC2的减少在急性肝衰竭的进展过程中,可能发挥重要的作用.
【期刊名称】《实用肝脏病杂志》
【年(卷),期】2010(013)005
【总页数】3页(P325-327)
【关键词】急性肝衰竭;组蛋白去乙酰化酶2;丙酮酸乙酯
【作者】李汛;何灿明;王鲁文;龚作炯
【作者单位】430060,武汉市,武汉大学人民医院感染病科;430060,武汉市,武汉大学人民医院感染病科;430060,武汉市,武汉大学人民医院感染病科;430060,武汉市,武汉大学人民医院感染病科
【正文语种】中文
真核生物主要通过调节染色体结构而进行转录调控，而对其转录影响最大的就是组蛋白的修饰作用，包括组蛋白的甲基化、磷酸化和乙酰化等。

乙酰化可引起特定基因的表达，而去乙酰化具有相反的作用[1]。

乙酰化修饰是由组蛋白乙酰化酶（histone deacetylase，HAT）和去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）共同调节的。

近年来研究发现，非组蛋白也可被乙酰化修饰，如 P53、NF-кB、
皮质激素受体和 STAT 等[2]，而后三者与炎症的发生密切相关[3]。

HDAC2减少
在糖皮质激素不能有效抑制NF-кB介导的基因表达过程中发挥至关重要的作用。

我们曾发现丙酮酸乙酯（ethyl pyruvate，EP）可以有效地保护D-氨基半乳糖诱
导的急性肝损伤[4]，其作用机制是通过抑制高迁移率族蛋白 B1（high mobility group box 1 protein，HMGB1）来抑制急性肝衰竭的发展。

有报道在一些肺部
疾病中HDAC2表达下降，活性减少[5]，但是在急性肝衰竭发生过程中HDAC2
的表达是否异常以及EP是否会对HDAC2的表达有影响尚未见研究报道。

鉴于此，本研究应用D-氨基半乳糖诱导大鼠急性肝衰竭模型，并采用EP进行干预治疗，
观察在不同时间点各组大鼠肝组织HDAC2的表达情况。

材料与方法
一、动物模型的制备将78只雄性清洁级Wistar大鼠（体质量180～220g，武汉大学动物实验中心提供）随机分为4组：①模型组24只，动物在禁食12h后腹
腔注射D-氨基半乳糖盐酸盐溶液（江苏省启东市经贸有限公司）1.2g.Kg-1；②
正常组6只，大鼠腹腔内注射等量的生理盐水；③EP干预组24只，于建模前2h 腹腔注射EP溶液（Sigma公司，乳酸钠林格氏液配制：Na+130mmol/L、
K+4mmol/L、Ca2+2.7mmol/L、Cl-139mmol/L、EP28mmol/L，pH=7.02）12.5mg.kg-1；④EP治疗组24只，于建模后2h腹腔注射EP溶液12.5 mg.kg-1。

除正常组（24h后处死）外，其余各组于建模后3、6、12、24h分别随机取
大鼠6只，用10%水合氯醛麻醉，留取肝组织，冻存于-70℃冰箱，备检。

二、肝组织HDAC2表达的检测取一部分肝组织制成蜡块，常规石蜡包埋、切片。

采用免疫组织化学法（S-P法）检测肝组织HDAC2的表达情况，即切片逐级脱蜡至水，微波抗原修复，加入兔抗大鼠HDAC2多克隆抗体和生物素化的羊抗兔多克隆抗体（均购于上海沪尚生物科技有限公司），工作浓度分别为1:100和1:50。

加入过氧化物酶标记的链酶亲合素，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片。

各标本在显微镜下随机选择5个视野，拍照后输入电脑，采用image-pro
plus6.0软件分析各组大鼠HDAC2的表达情况，分析各组肝组织积分光密度（IOD）/阳性面积（Area）。

三、肝组织匀浆HDAC2水平检测在99mlRIPA裂解液（江苏省海门市碧云天研
究所）中加入PMSF（Sigma公司）1ml，使PMSF终浓度为1mM，摇匀，备用。

每只大鼠取200mg肝组织，加入混合裂解液2ml，充分匀浆后，12000g离心4分钟，取上清1ml，置于-20℃冰箱保存，待测。

采用ELISA法检测HDAC2水平，按试剂盒（购于美国R&D公司）说明书进行操作。

四、统计学分析采用SPSS13.0软件进行统计学分析。

计量资料以±s表示，采用方差分析和t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果
一、肝组织HDAC2的表达情况 HDAC2主要表达于细胞核内，与正常组相比，
在模型组3、6、12、24小时各时间点，HDAC2的表达量逐渐减少（图1～图5）。

以IOD/Area作为统计指标分析发现，与正常组相比，EP干预组、模型组
及EP治疗组均有明显差异（P＜0.05）；后三者间相比，两两间无明显差异（P＞0.05）。

与正常组相比，模型组3、6h无明显差异（P＞0.05），而12h和24h
存在明显差异（P＜0.01）。

与模型组3h相比，6h无明显差异（P＞0.05），12、24h 存在差异（P＜0.05）；与模型组6h相比，12h无明显差异（P＞0.05），
24h存在差异（P＜0.05）；模型组12h与24h相比，两者之间无明显差异（P＞0.05，表 1）。

图1 正常组肝组织HDAC2表达（S-P法，×400）
图2 造模3h肝组织HDAC2表达（S-P法，×400）
图3 造模6h肝组织HDAC2表达（S-P法，×400）
图4 造模12h肝组织HDAC2表达（S-P法，×400）
图5 造模24h肝组织HDAC2表达（S-P法，×400）
表1 各组肝组织HDAC2表达的计量分析与正常组比，①P＜0.05，②P＜
0.01IOD/Area正常组0.1125±0.0047模型组3h 0.1068±0.00196h
0.0985±0.0040①12h 0.0817±0.0118②24h 0.0726±0.0111②EP干预组 3h 0.0897±0.00326h 0.0811±0.001612h 0.0855±0.001324h 0.0816±0.0100 EP 治疗组3h 0.0926±0.00416h 0.0804±0.016512h 0.0805±0.011524h
0.0801±0.0028
二、肝组织匀浆HDAC2水平见图6（结果以ng/ml表示，±s）。

图6 肝组织匀浆HDAC2水平
讨论
在重型肝炎发生时，常伴有内毒素血症及大量的炎症因子释放。

内毒素作为配体与TLR4结合后触发一系列信号级联反应，诱导NF-кB、AP-1、IRF-3等转录因子磷酸化和核转位，上调 TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8和IFN-α等细胞因子的表达[6]。

在激活的炎症因子转录因子里，NF-кB与肝损伤密切相关。

大量的研究表明，NF-кB在各种原因造成的肝损伤中起着重要的作用[7]。

NF-кB 可分为 2 类，第 1 类包括 NF-кB1和NF-кB2，由于缺乏转录激活区，无独立激活基因转录的功能；第2 类包括 RelA（P65）、RelB 和 C-Rel，具有激活基因转录功能[8]。

通常所指的NF-кB即是第2类中的P50/RelA（P65）异二聚体。

有研究显示，HDAC1、
HDAC2能够抑制NF-кB依赖的基因表达，其机制是HDAC1和HDAC2共同作
用于NF-кB的P65亚基[9]，使其去乙酰化，而使NF-кB失去转录活性。

EP是一种稳定的亲脂性丙酮酸衍生物，能通过降解谷胱甘肽成为二硫化物，使细胞内氧化还原状态发生改变，从而抑制NF-кB的转位以及p38丝裂原活化蛋白激酶的信号转导，并且抑制炎性介质的释放[10]，能够拮抗炎症因子HMGB1，从而有效地保护D-氨基半乳糖诱导的急性肝损伤。

本研究应用D-氨基半乳糖盐酸盐诱导大鼠急性肝衰竭模型，并采用EP进行干预
治疗，结果显示：HDAC2主要表达于细胞核内，与文献[11]报道一致。

在急性肝衰竭过程中，HDAC2的表达量较正常减少。

而EP作为HMGB1拮抗剂，虽然对肝脏有保护作用，但不能影响HDAC2的表达。

参考文献
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