利用Hoechst_33342-PI荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响

㊀山东农业科学㊀２０２３ꎬ５５(２):１２７~１３４ＳｈａｎｄｏｎｇＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ
㊀ＤＯＩ:１０.１４０８３/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１－４９４２.２０２３.０２.０１７
收稿日期:２０２２－０５－２１
基金项目:天津市农业科学院财政种业创新研究项目(２０２２ＺＹＣＸ０１７)ꎻ天津市农业科学院青年科研人员创新研究与实验项目(２０２１００４)作者简介:贲海燕(１９８２ )ꎬ女ꎬ博士ꎬ助理研究员ꎬ主要从事蔬菜病害诊断与防治研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｂｅｎｈａｉｙａｎ５０６＠１６３.ｃｏｍ通信作者:郝永娟(１９７１ )ꎬ女ꎬ硕士ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病害研究ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｔｊｚｂｓｈｙｊ＠１６３.ｃｏｍ
利用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法评价氰氨化钙
对茄病镰刀菌生物活性的影响
贲海燕１ꎬ霍建飞１ꎬ姚玉荣１ꎬ高苇１ꎬ王万立１ꎬ郝永娟１ꎬ曲红云２ꎬ张雪岩２
(１.天津市农业科学院植物保护研究所ꎬ天津㊀３００３８１ꎻ２.黑龙江省农业科学院园艺分院ꎬ黑龙江哈尔滨㊀１５００６９)㊀㊀摘要:本试验以茄病镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉ)为研究对象ꎬ探索了Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及ＰＩ荧光染剂对病菌不同活性孢子的色泽差异ꎬ明确了病原菌经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色后的活孢子发蓝色荧光ꎬ最佳染色浓度和时间为１μｇ/ｍＬ㊁２０ｍｉｎꎻ碘化丙啶(ＰＩ)染色后的死孢子发红色荧光ꎬ最佳染色浓度和时间为３μｇ/ｍＬ㊁１０ｍｉｎꎮ并由此建立了Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染技术ꎬ应用该技术可快速㊁清晰地甄别出不同浓度氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活性和萌发的影响ꎬ结果表明ꎬ氰氨化钙对茄病镰刀菌的灭杀效果随着浓度增高而增强ꎬ且与处理时间呈正相关ꎮ２０００ｍｇ/Ｌ氰氨化钙处理３ｈꎬ孢子致死率高达８３.９７％ꎻ５００~１０００ｍｇ/Ｌ处理３ｈꎬ孢子致死率为７.１５％~２６.８０％ꎬ孢子萌发率为２.４０％~３.５９％ꎬ处理４８ｈ时ꎬ孢子致死率达９２.０７％~１００％ꎮ２５０ｍｇ/Ｌ氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死效果微弱或没有影响ꎮ本研究通过菌丝速率法和生物量法进一步验证了应用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响是可行的ꎮ这为突破植物病原微生物药剂室内常规筛选方法提供了新的思路和技术手段ꎮ
关键词:Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法ꎻ氰氨化钙ꎻ茄病镰刀菌ꎻ生物活性
中图分类号:Ｓ４３２.４＋４㊀㊀文献标识号:Ａ㊀㊀文章编号:１００１－４９４２(２０２３)０２－０１２７－０８
ＥｆｆｅｃｔｏｆＣａｌｃｉｕｍＣｙａｎａｍｉｄｅｏｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉＥｖａｌｕａｔｅｄｂｙＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２￣ＰＩＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＤｏｕｂｌｅＳｔａｉｎｉｎｇＭｅｔｈｏｄ
ＢｅｎＨａｉｙａｎ１ꎬＨｕｏＪｉａｎｆｅｉ１ꎬＹａｏＹｕｒｏｎｇ１ꎬＧａｏＷｅｉ１ꎬＷａｎｇＷａｎｌｉ１ꎬＨａｏＹｏｎｇｊｕａｎ１ꎬＱｕＨｏｎｇｙｕｎ２ꎬＺｈａｎｇＸｕｅｙａｎ２
(１.ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｌａｎｔＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＴｉａｎｊｉｎＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＴｉａｎｊｉｎ３００３８１ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＧａｒｄｅｎｉｎｇＢｒａｎｃｈꎬＨｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓꎬＨａｒｂｉｎ１５００６９ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ㊀ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２￣ＰＩｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｏｒａｐｉｄｌｙａｎｄｃｌｅａｒｌｙｄｅｔｅｒｍｉｎｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅｏｎｔｈｅｓｐｏｒｅｖｉａｂｉｌｉｔｙａｎｄｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｂａｓｅｄｏｎｔｈｅｃｏｌｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｏｆｓｐｏｒｅｓｗｉｔｈｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖｉａｂｉｌｉｔｙ.ＩｔｗａｓｃｌｅａｒｔｈａｔｔｈｅｌｉｖｉｎｇｓｐｏｒｅｓｓｈｏｗｅｄｂｌｕｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｆｔｅｒｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２ꎬａｎｄｔｈｅｂｅｓｔｓｔａｉｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎ￣ｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｉｍｅｗｅｒｅ１μｇ/ｍＬａｎｄ２０ｍｉｎꎻｔｈｅｄｅａｄｓｐｏｒｅｓｓｈｏｗｅｄｒｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｆｔｅｒｓｔａｉｎｅｄｗｉｔｈｐｒｏｐｉ￣ｄｉｎｅｉｏｄｉｄｅ(ＰＩ)ꎬａｎｄｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｓｔａｉｎｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎａｎｄｔｉｍｅｗｅｒｅ３μｇ/ｍＬａｎｄ１０ｍｉｎ.ＴｈｅｋｉｌｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅｏｎＦ.ｓｏｌａｎｉｉｎｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｉｔｓｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬａｎｄｗａｓｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙｃｏｒｒｅｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｒｅａｔｉｎｇｔｉｍｅ.Ａｆｔｅｒｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ２０００ｍｇ/Ｌｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅｆｏｒ３ｈꎬｔｈｅｃｏｎｉｄｉａｌｍｏｒ￣ｔａｌｉｔｙｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄ８３.９７％.Ｗｈｅｎｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈ５００~１０００ｍｇ/Ｌｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅꎬｔｈｅｃｏｎｉｄｉａｌｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅａｎｄｔｈｅｃｏｎｉｄｉａｌｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｒａｔｅｗｅｒｅ７.１５％~２６.８０％ａｎｄ２.４０％~３.５９％ａｆｔｅｒ３ｈꎬａｎｄｔｈｅｃｏｎｉｄｉａｌｍｏｒｔａｌｉｔｙｒａｔｅｒｅａｃｈｅｄ９２.０７％~１００％ａｆｔｅｒ４８ｈ.Ｔｈｅｌｅｔｈａｌｅｆｆｅｃｔｏｆ２５０ｍｇ/ＬｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅｏｎＦ.ｓｏｌａ￣
ｎｉｗａｓｗｅａｋｏｒｎｏ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙꎬｔｈｅｍｙｃｅｌｉｕｍｇｒｏｗｔｈｒａｔｅａｎｄｂｉｏｍａｓｓｍｅｔｈｏｄｓｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏｃｏｎｆｉｒｍｔｈａｔＨｏ￣ｅｃｈｓｔ３３３４２￣ＰＩｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄｗａｓｆｅａｓｉｂｌｅａｎｄｅｆｆｉｃｉｅｎｔｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅｏｎｓｐｏｒｅｖｉａｂｉｌｉｔｙｏｆＦ.ｓｏｌａｎｉ.Ｉｔｐｒｏｖｉｄｅｄａｎｅｗｉｄｅａａｎｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｆｏｒｓｃｒｅｅｎｉｎｇｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓｔｏｐｌａｎｔｐａｔｈｏｇｅｎｓ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２￣ＰＩｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｏｕｂｌｅｓｔａｉｎｉｎｇｍｅｔｈｏｄꎻＣａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅꎻＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａ￣ｎｉꎻＢｉｏｌｏｇｉｃａｌａｃｔｉｖｉｔｙ
㊀㊀氰氨化钙作为农用化学肥料ꎬ已有１００余年的使用历史[１]ꎬ我国在２０世纪６０年代主要将其用作氮肥[２]ꎮ２１世纪初期ꎬ大量田间数据显示氰氨化钙还是一种高效㊁环境友好型的土壤消毒剂[３－５]ꎬ能有效防治芸薹根肿菌(Ｐｌａｓｍｏｄｉｏｐｈｏｒａｂｒａｓｓｉｃａｅ)[６ꎬ７]㊁尖孢镰刀菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)等引起的多种土传病害[８ꎬ９]ꎬ而关于茄病镰刀菌(Ｆ.ｓｏｌａｎｉ)引起的瓜类作物病害防治的相关报道较少ꎮＢｏｕｒｂｏｓ等[１０]通过田间试验表明ꎬ氰氨化钙能有效控制由茄病镰刀菌引起的黄瓜根腐病ꎮ常规作用于微生物的药剂筛选主要建立在室内生物活性测定ꎮ荧光染色法是医学方面检测细胞凋亡和细胞坏死的重要手段ꎮ细胞凋亡的主要形态特征是细胞体积缩小㊁孢浆凝缩而不外漏ꎬ核染色质固缩ꎻ而细胞坏死的主要形态特征是细胞肿胀ꎬ体积增大ꎬ或ＤＮＡ降解ꎬ细胞破裂ꎬ胞浆外漏等ꎮ根据这些特征ꎬ选择适合的荧光染料ꎬ可以准确判断细胞的活力状态ꎮ植物病原微生物细胞凋亡的表型和生理特征与动物细胞相似ꎬ而且细胞结构和代谢过程更为简单ꎮ目前ꎬ荧光染色法在植物微生物研究方面仅有少数报道[１１－１４]ꎮ本试验以茄病镰刀菌为研究对象ꎬ根据Ｈｏ￣ｅｃｈｓｔ３３３４２㊁碘化丙啶(ｐｒｏｐｉｄｉｎｅｉｏｄｉｄｅꎬＰＩ)荧光染剂对生物细胞活性的不同作用效果ꎬ研发快速甄别病原菌死活的荧光染色技术ꎮ并基于该技术检测氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活性的影响ꎬ旨在创建快速㊁准确㊁灵敏的活性检测方法ꎬ为植物病原微生物药剂筛选的有效性提供新的思路和检测技术手段ꎮ同时ꎬ依据药剂筛选常用的室内生物活性测定法ꎬ如菌落生长㊁菌丝生物量㊁孢子萌发等指标[１５－１７]ꎬ设计测定了氰氨化钙对茄病镰刀菌的抑制效果ꎬ为进一步开展氰氨化钙防治由茄病镰刀菌引起的作物病害提供理论依据ꎮ
１㊀材料与方法
１.１㊀供试材料
供试菌株:茄病镰刀菌瓜类专化型(Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｆ.ｓｐ.ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ)ꎬ由中国农业科学院蔬菜花卉研究所菜病综防组鉴定保存(菌株编号:
ＨＧ０９０３１５０１０２)ꎮ
供试药剂:氰氨化钙(ｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅꎬＣａＣＮ２)ꎬ直径１~６ｍｍ黑色粉末状ꎬ氰氨化钙含量５０％ꎬ氮含量２０％ꎬ钙含量３８％ꎬ由宁夏大荣实业集团有限公司提供ꎮ
供试试剂:ＮａＣｌ㊁ＫＣｌ㊁Ｎａ２ＨＰＯ４ １２Ｈ２Ｏ㊁ＮａＨ２ＰＯ４㊁丙酮㊁冰醋酸㊁松柏油等均购自北京化工厂有限责任公司ꎮ
仪器设备:ＨＱ－６０型旋涡混合器(北京北方同正生物技术发展有限公司)ꎻ３Ｋ１５型高速离心机(德国Ｓｉｇｍａ公司)ꎻＵＶ－１８０１型紫外可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)ꎻ移液枪(德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司)ꎻＤＰ７２型奥林巴斯荧光显微镜(日本奥林巴斯公司)ꎻＸＭＴＤ－７００水浴锅(江苏省金坛市汉康电子有限公司)ꎮ
荧光染料:Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２㊁碘化丙啶(ｐｒｏｐｉ￣ｄｉｎｅｉｏｄｉｄｅꎬＰＩ)ꎬ购于Ｓｉｇｍａ公司ꎮ
１.２㊀荧光染液配制
ＰＢＳ缓冲液配制:ＫＣｌ０.２０ｇ/ＬꎬＮａＣｌ８.００ｇ/ＬꎬＮａＨ２ＰＯ４０.２０ｇ/ＬꎬＮａ２ＨＰＯ４ １２Ｈ２Ｏ２.８９ｇ/ＬꎬｐＨ７.４ꎮＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染液配制:称取０.００１ｇＨｏ￣ｅｃｈｓｔ３３３４２ꎬ加入１０ｍＬ０.０１ｍｏｌ/ＬＰＢＳ(ｐＨ７.４)缓冲液ꎬ配成１００μｇ/ｍＬ的母液ꎬ４ħ避光保存ꎮ使用前用ＰＢＳ(ｐＨ７.４)将其稀释成所需浓度ꎮ碘化丙啶(ＰＩ)染液配制:称取０.００１ｇＰＩꎬ加入１０ｍＬ０.０１ｍｏｌ/Ｌ的ＰＢＳ(ｐＨ７.４)缓冲液ꎬ配成１００μｇ/ｍＬ的母液ꎬ４ħ避光保存ꎮ使用前用ＰＢＳ(ｐＨ７.４)将其稀释成所需浓度ꎮ
１.３㊀茄病镰刀菌孢子悬浮液的制备
在２５０ｍＬＰＤ培养基中接种茄病镰刀菌菌饼ꎬ２６ħ㊁１５０ｒ/ｍｉｎ振荡培养４ｄꎬ获得分生孢子培养液ꎬ将培养液经灭菌４层纱布过滤ꎬ收集滤液
８２１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
经５０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ弃上清液ꎬ用无菌水重悬制成１ˑ１０６个/ｍＬ孢子悬液备用ꎮ
１.４㊀茄病镰刀菌无活力孢子的制备
茄病镰刀菌孢子致死处理采用恒温水浴热处理法ꎬ取１ｍＬ新鲜孢子悬浮液于１００ħ沸水浴条件下热处理１０ｍｉｎ致死ꎮ
１.５㊀荧光染料对茄病镰刀菌染色效果评价取新配制的有活力和无活力的茄病镰刀菌孢子悬浮液各１ｍＬꎬ５０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ弃上清ꎻ将Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和ＰＩ母液分别稀释至３μｇ/ｍＬ后各取５００μＬꎬ重悬沉淀使孢子浓度为２ˑ１０６个/ｍＬꎻ室温下避光静置染色２０ｍｉｎꎬ分别吸取１０μＬ孢子染液于载玻片上ꎬ加盖玻片后在荧光显微镜下观察拍照ꎬ记录各荧光染料孵育下死活孢子的染色特征ꎮ
１.６㊀荧光双染法对茄病镰刀菌染色效果评价Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ双染法:取新配制的有活力和无活力的茄病镰刀菌孢子悬浮液各１ｍＬꎬ混匀后经５０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ向孢子沉淀中加入５００μＬ浓度为１μｇ/ｍＬＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染液ꎬ常温避光孵育５ｍｉｎ后ꎬ加入５００μＬ浓度为１μｇ/ｍＬ的ＰＩ染液ꎬ常温避光染色５ｍｉｎꎬ吸取１０μＬ孢子染液于载玻片上ꎬ在荧光显微镜下观察并拍照ꎮ
１.７㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和ＰＩ最佳染色浓度及染色时间筛选
取新鲜有活力㊁浓度为１ˑ１０６个/ｍＬ茄病镰刀菌孢子悬浮液１ｍＬꎬ５０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ弃上清ꎬ分别重悬于浓度为１㊁３㊁６㊁９μｇ/ｍＬ的染料５００μＬꎬ使孢悬液浓度为２ˑ１０６个/ｍＬꎮ每个浓度分别染色５㊁１０㊁１５㊁２０ｍｉｎꎬ每个处理重复３次ꎮ于２０倍荧光显微镜下ꎬ每个处理观察３个视野ꎬ每个视野不少于１００个孢子ꎬ观察并记录孢子的染色效果并计算死亡率ꎮ
孢子死亡率(％)＝
死亡孢子数
视野中总孢子数
ˑ１００㊀ꎮ
１.８㊀氰氨化钙对茄病镰刀菌室内生物活性的测定１.８.１㊀基于Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响㊀将斜面保存的茄病镰刀菌菌株进行活化ꎬＰＤＡ平板上黑暗培养７天后ꎬ配制成有活力的茄病镰刀菌孢子悬浮液(１ˑ１０６个/ｍＬ)分装到离心管中ꎬ每管１０ｍＬ备用ꎻ分别称取氰氨化钙０㊁０.００５㊁０.０１㊁０.０２㊁０.０４ｇ溶解于上述孢子悬浮液中ꎬ配制成氰氨化钙浓度分别为０㊁５００㊁１０００㊁２０００㊁４０００μｇ/ｍＬ的孢子悬浮混合液ꎬ每个浓度３次重复ꎮ分别在药剂处理０㊁１０ｍｉｎ和３㊁９㊁４８㊁７２ｈ后ꎬ按１.７中的Ｈｏ￣ｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ双染法进行染色ꎬ在２０倍荧光显微镜下ꎬ依据孢子荧光颜色ꎬ记录死㊁活孢子总量ꎬ其中死孢子发红色荧光ꎬ活孢子发蓝色荧光ꎬ凋亡孢子(处于死活之间)发蓝粉色荧光ꎮ每个样本观察５个视野ꎬ每个视野内孢子数量不少于１００个ꎬ用以下公式计算孢子死亡率和萌发率ꎮ
孢子死亡率(％)＝ａａ＋ｂˑ１００㊀ꎻ
孢子萌发率(％)＝ｃａ＋ｂˑ１００㊀ꎮ
式中:ａ为显微镜视野中发红色荧光孢子总数ꎻｂ为显微镜视野中发蓝色荧光孢子总数ꎻｃ为显微镜视野中发蓝色荧光且萌发的孢子总数ꎮ１.８.２㊀氰氨化钙对茄病镰刀菌菌落生长影响的研究㊀采用菌丝生长速率法[１８]测定ꎮ称取氰氨化钙０㊁０.００２㊁０.００５㊁０.０１㊁０.０２㊁０.０３㊁０.０４㊁０.０５㊁０.０６ｇ分别溶解在２０ｍＬ５０~５５ħ的ＰＤＡ培养基中ꎬ配制成０㊁１００㊁２５０㊁５００㊁１０００㊁１５００㊁２０００㊁２５００㊁３０００ｍｇ/Ｌ的含药培养基ꎬ充分混匀倒平板ꎬ待平板凝固后在平板中央接种茄病镰刀菌菌饼(直径５ｍｍ)ꎬ以不加氰氨化钙的ＰＤＡ培养基接种茄病镰刀菌为对照ꎮ２８ħ黑暗培养ꎬ每隔４８ｈ测量一次菌落直径ꎬ用十字交叉法计算菌落平均直径ꎬ每处理３次重复ꎮ
抑菌率(％)＝(对照菌落直径－处理菌落直径)/(对照菌落直径－菌饼直径)ˑ１００ꎮ１.８.３㊀氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝生长量和产孢量影响的研究㊀称取不同剂量氰氨化钙加入ＰＤ培养液中ꎬ得到终浓度分别为０㊁１００㊁２５０㊁５００㊁１０００㊁１５００㊁２０００㊁２５００㊁３０００ｍｇ/Ｌ的１００ｍＬ含药培养液ꎮ在培养５ｄ的茄病镰刀菌菌落边缘打取５ｍｍ菌饼ꎬ每瓶接种３个菌饼ꎬ每个处理３次重复ꎬ以不加氰氨化钙的培养液为对照ꎮ２５ħ㊁１２０ｒ/ｍｉｎ振荡培养３ｄ后ꎬ真空抽滤滤出菌丝ꎬ用灭菌水冲洗３次ꎬ除去菌饼ꎬ与事先烘干
９２１
㊀第２期㊀㊀贲海燕ꎬ等:利用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响
至恒重的滤纸一同置于８０ħ烘箱中烘干至恒重ꎬ称量菌丝干重ꎻ收集过滤孢子悬浮液ꎬ用血球计数板记录各处理的孢子浓度ꎬ明确氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝量和产孢量的影响ꎮ
１.９㊀数据处理与分析
数据采用ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＥｘｃｅｌ进行整理ꎬ采用ＳＰＳＳ２６.０对数据进行单因素ＡＮＯＶＡ分析ꎬＰ<０.０５表示差异显著ꎮ２㊀结果与分析
２.１㊀各荧光染料对茄病镰刀菌染色效果评价新制备的茄病镰刀菌孢子悬浮液经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色后ꎬ荧光显微镜下观察发现ꎬ有活力孢子均匀分散ꎬ发明亮的蓝色荧光(图１)ꎮ经热处理致死的孢子ꎬ在荧光显微视野下不发荧光ꎬ该方法仅能观察到有活力的孢子ꎬ不能检测死亡孢子
ꎮ
Ａ:孢子悬液经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色(２００ˑ)ꎻＢ:孢子悬液经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色(４００ˑ)ꎮ
图１㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染色后茄病镰刀菌孢子的染色特征
㊀㊀新制备的茄病镰刀菌孢子悬浮液经普通显微
镜观察无法区分死㊁活孢子(图２Ａ)ꎻ而经ＰＩ染
色ꎬ在荧光显微镜下观察ꎬ有活力的孢子不发荧
光ꎬ死亡孢子发红色荧光(图２Ｂ)ꎮ经高温处理致
死的孢子ꎬ在荧光显微镜下观察ꎬ细胞界限清晰ꎬ
均匀分散ꎬ发出强烈的红色荧光ꎮ该方法只能观
察到死孢子ꎬ不能检测有活力的孢子
ꎮ
Ａ:普通显微镜下孢子悬液经ＰＩ染色(２００ˑ)ꎻＢ:荧光显微镜下孢子悬液经ＰＩ染色(２００ˑ)ꎮ
图２㊀ＰＩ染色后茄病镰刀菌孢子的染色特征
２.２㊀荧光双染法对茄病镰刀菌染色效果评价
茄病镰刀菌死㊁活孢子混合悬浮液在普通显
微镜下无法区分(图３Ａ)ꎻ而经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ
双染后ꎬ在荧光显微镜下观察ꎬ有活力的孢子发蓝
色荧光ꎬ死亡孢子发红色荧光ꎬ二者颜色反差强
烈ꎬ且死亡孢子分散度较好ꎬ无聚集现象(图３Ｂ)ꎮ
该方法可将死㊁活孢子在同一视野中区分开ꎬＨｏ￣
ｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染可作为茄病镰刀菌孢子
活力检测及评价的有效方法ꎮ
２.３㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ双染法最佳染色条件
荧光染料有一定毒性ꎬ浓度过高或是染色时
间过长可能对孢子活性产生不利影响ꎮ本研究发
现茄病镰刀菌孢子对Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和ＰＩ的敏感
程度存在差异ꎮ
结果表明(表１)ꎬＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染液浓度
１~３μｇ/ｍＬ对孢子的毒性较小ꎬ随着染色时间的０３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
延长孢子死亡率差异不显著ꎬ为０.５１％~０.９３％ꎻ染液浓度６μｇ/ｍＬ在１５ｍｉｎ时的死亡率显著增加ꎬ染色２０ｍｉｎ的死亡率为２.６０％ꎻ染液浓度为９μｇ/ｍＬ对孢子表现出明显的毒性ꎬ孢子死亡率显
著增加ꎬ染色５ｍｉｎ时死亡率为１２.０７％ꎬ２０ｍｉｎ时达２２.０１％ꎮ结合荧光显微镜观察ꎬ１μｇ/ｍＬ染色效果明显ꎬ孢子边界清晰ꎬ较长时间染色效果更稳定ꎬ综合判定Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２染液最佳浓度为１μｇ/ｍＬꎬ染色时间为２０
ｍｉｎꎮ
Ａ:普通显微镜下孢子悬液经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ染色(２００ˑ)ꎻ
Ｂ:荧光显微镜下孢子悬液经Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ染色(２００ˑ)(活孢子发蓝色荧光ꎬ死亡孢子发红色荧光)ꎮ
图３㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ染色后茄病镰刀菌孢子的染色特征
㊀㊀ＰＩ染液致死率与染液浓度和染色时间呈正相关(表１)ꎮＰＩ染液浓度１~３μｇ/ｍＬ随着染色时间的增加ꎬ孢子死亡率差异不显著ꎬ其中染液浓度３μｇ/ｍＬ染色１０ｍｉｎ时染色清晰程度趋于稳定ꎬ死亡率为０.８１％ꎻ染色浓度６μｇ/ｍＬ的致死率
增加明显ꎬ染色２０ｍｉｎ的死亡率为５.２１％ꎻ染液浓度９μｇ/ｍＬ的死亡率高达１９.５７％~３１.１２％ꎮ综合分析ꎬＰＩ染液最佳浓度为３μｇ/ｍＬꎬ染色时间为１０ｍｉｎꎬ此时死孢子发出强烈的红色荧光ꎬ分散度较好ꎮ
㊀㊀表１㊀
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和ＰＩ染液在不同染色条件下茄病镰刀菌孢子死亡率
(％)时间(ｍｉｎ)
Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２(μｇ/ｍＬ)
１
３
６
９
ＰＩ(μｇ/ｍＬ)
１
３
６
９
５
０.５３ʃ０.４６ｅ０.７６ʃ０.０４ｅ１.０１ʃ０.４３ｅ
１２.０７ʃ１.５４ｃ０.６ʃ０.６８ｇ
０.７７ʃ０.０９ｇ１.８７ʃ０.２６ｆｇ１９.５７ʃ１.６７ｄ１００.５１ʃ０.４４ｅ０.７５ʃ０.０５ｅ１.５８ʃ０.１２ｄｅ１５.３７ʃ０.２４ｂ０.７２ʃ０.０５ｇ０.８１ʃ０.８１ｇ
２.５６ʃ０.４７ｆ
２１.８３ʃ０.６９ｃ
１５０.７２ʃ０.０２ｅ０.９３ʃ０.４０ｅ２.４８ʃ０.３０ｄ２１.４２ʃ１.０３ａ０.９０ʃ０.４１ｇ０.９８ʃ０.４７ｆｇ４.２０ʃ０.４２ｅ２６.１６ʃ２.０９ｂ２００.７６ʃ０.０３ｅ
０.８２ʃ０.０５ｅ
２.６０ʃ０.５５ｄ
２２.０１ʃ２.３５ａ
０.８２ʃ０.０２ｇ
１.２１ʃ０.５０ｆｇ５.２１ʃ０.１４ｅ３１.１２ʃ１.７３ａ㊀㊀注:表中数据后不同小写字母表示同一染料㊁不同浓度和染色时间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ
２.４㊀基于Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子活力的影响
通过荧光显微镜能直观监测氰氨化钙不同浓度处理对茄病镰刀菌孢子死活和萌发的影响ꎮ结果表明ꎬ氰氨化钙对茄病镰刀菌的杀灭效果与其处理浓度和处理时间呈正相关(图４)ꎮ氰氨化钙处理１０ｍｉｎꎬ各处理的孢子致死效果不明显ꎬ死亡率接近零ꎻ处理３ｈꎬ氰氨化钙１０００ｍｇ/Ｌ和２０００ｍｇ/Ｌ的孢子致死率分别为２６.８０％和８３.９７％ꎬ２５０ｍｇ/Ｌ和５００ｍｇ/Ｌ的孢子致死率仅为９.２０％和７.１５％ꎻ随着氰氨化钙处理时间的延长ꎬ死亡孢
子逐渐增多ꎬ处理４８ｈ时ꎬ氰氨化钙５００~２０００
ｍｇ/Ｌ时的孢子致死率高达９２.０７％~１００％ꎮ２５０ｍｇ/Ｌ的致死效果微弱ꎬ处理７２ｈ的孢子致死率仅
为５.６４％ꎮ
氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子萌发的抑制作用随着浓度和处理时间的增加而增强(图５)ꎮ处理
１０ｍｉｎꎬ１０００~２０００ｍｇ/Ｌ对孢子萌发已表现一定的抑制作用ꎬ萌发率为３.１５％~３.３３％ꎻ处理３ｈꎬ２０００ｍｇ/Ｌ的孢子萌发率为零ꎬ５００~１０００ｍｇ/Ｌ的孢子萌发率为２.４０％~３.５９％ꎬ与对照相比降低５６.５４％~７０.９４％ꎻ随着处理时间延长ꎬ氰氨化钙的抑菌作用进一步增强ꎬ处理４８ｈꎬ１０００ｍｇ/Ｌ时的孢子萌发率为零ꎬ５００ｍｇ/Ｌ时的孢子１
３１㊀第２期㊀㊀贲海燕ꎬ等:利用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响
萌发率降至２.８４％ꎬ与对照相比降低６０.５０％ꎻ处理７２ｈꎬ５００ｍｇ/Ｌ时的孢子萌发情况与４８ｈ相当ꎬ趋于稳定ꎮ２５０ｍｇ/Ｌ对孢子萌发几乎没有抑
制作用ꎬ后期还有一定的促进作用ꎬ可能是低浓度氰氨化钙在毒性微弱的情况下ꎬ为茄病镰刀菌提供了氮源更有利于其萌发
ꎮ
图中不同小写字母表示同一处理时间不同浓度间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎬ下同ꎮ
图４㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ
双染法检测氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死效果
图５㊀Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ双染法检测氰氨化钙对茄病镰刀菌孢子萌发的影响
２.５㊀氰氨化钙对茄病镰刀菌菌落生长的影响
在含有不同浓度氰氨化钙的ＰＤＡ培养基上
进行抑菌试验ꎬ结果表明除低浓度以外ꎬ氰氨化钙的抑菌效果随浓度的增加而增强ꎬ但随着处理天数的延长ꎬ抑菌效果逐渐减弱(表２)ꎮ低浓度氰氨化钙(１００~５００ｍｇ/Ｌ)对茄病镰刀菌的生长有一定的促进作用ꎬ比对照处理生长速率快ꎬ这可能是由于低浓度氰氨化钙释放的有毒物质氰氨不足
以对茄病镰刀菌产生毒性ꎬ反而其提供的氮源被茄病镰刀菌充分利用促其生长ꎮ培养２ｄ时ꎬ氰氨化钙１０００~３０００ｍｇ/Ｌ的抑菌效果逐渐增强ꎬ抑菌率为４８.２６％~１００％ꎻ培养５ｄ抑菌作用减弱ꎬ１０００~
２５００ｍｇ/Ｌ的抑菌率为４.８８％~２５.６６％ꎬ可能是氰氨有毒物质分解完全ꎬ茄病镰刀菌恢复生长ꎮ３０００ｍｇ/Ｌ氰氨化钙为茄病镰刀菌菌丝生长致死浓度ꎬ抑菌率为１００％ꎮ
㊀㊀表２㊀
氰氨化钙对茄病镰刀菌菌落生长的影响
氰氨化钙浓度(ｍｇ/Ｌ)处理天数２
菌落直径(ｃｍ)抑菌率(％)
５
菌落直径(ｃｍ)抑菌率(％)７
菌落直径(ｃｍ)抑菌率(％)１００２.３４ʃ０.０６ａ－６.９８
５.２３ʃ０.０３ａ
－１３.５１５.３６ʃ０.１０ａｂ－２.３２２５０２.３６ʃ０.０９ａ－８.１４５.０３ʃ０.１０ａｂ－８.７１
５.４０ʃ０.００ａｂ－３.１６５００
２.２１ʃ０.０５ａ
０.５８
５.２７ʃ０.０６ａ－１４.３１５.５０ʃ０.００ａ
－５.２６１０００１.３９ʃ０.１４ｂ４８.２６４.４７ʃ０.１４ｃ４.８８５.４０ʃ０.０２ａｂ－３.１６１５００１.１４ʃ０.０７ｃ６２.７９３.９８ʃ０.１３ｄ１６.６７５.２０ʃ０.０５ａｂ１.０５２００００.９９ʃ０.０４ｃ７１.５１３.８３ʃ０.３３ｄ２０.２６５.１３ʃ０.１３ｂ２.５３２５０００.６３ʃ０.２３ｄ９２.４４３.６０ʃ０.４０ｄ２５.６６４.８２ʃ０.０６ｃ９.０５
３００００.５０ʃ０.００ｄ１００.０００.５０ʃ０.００ｅ１００.０００.５０ʃ０.００ｄ１００.０００１.７２ʃ０.１０ａ ４.６７ʃ０.２５ｂｃ ５.２５ʃ０.１３ａｂ
㊀㊀注:同列数据后不同小写字母表示差异显著(Ｐ<０.０５)ꎮ
２
３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀
２.６㊀氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝生长量和产孢量的影响
由图６可知ꎬ１００ｍｇ/Ｌ氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝生长量没有抑制作用ꎬ与对照处理差异不显著ꎬ但其对病菌产孢抑制作用明显ꎬ产孢量与对照相比降低４０.４３％(图７)ꎮ随着氰氨化钙浓度增加ꎬ茄病镰刀菌的菌丝生长量和产孢量逐渐降低ꎬ３０００ｍｇ/Ｌ抑菌作用最强ꎬ菌丝生长量和产孢量与对照相比分别降低８５.００％和
９７.３２％ꎮ
不同小写字母表示不同浓度间差异显著(Ｐ<０.０５)ꎬ下同ꎮ
图６㊀
氰氨化钙对茄病镰刀菌菌丝生长量的影响
图７㊀氰氨化钙对茄病镰刀菌产孢量的影响
３㊀讨论与结论
荧光染色技术已在医学㊁神经学㊁微生物学及遗传学等研究学科得到了广泛应用ꎬ然而该技术在农业生产以及食品安全领域的研究相对较少ꎮ不同荧光染料可对不同活性的细胞进行染色ꎬ因此ꎬ不同荧光染料合理的结合使用ꎬ可以达到检测细胞活性的目的[１３]ꎮ本试验采用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２和ＰＩ荧光染料分别对茄病镰刀菌孢子的活力进行了荧光显微镜观察ꎮ其中荧光染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２的染色机理是直接作用有活性细胞的ＤＮＡ上[１３ꎬ１９]ꎬ在荧光显微镜下孢子发蓝色荧光ꎬ无聚集现象ꎮＰＩ染色机理是对失去细胞膜完整性的死细胞进行染色ꎬ并发强烈的红色荧光ꎬ死细胞较多时会有少量聚集现象ꎬ但不影响观察计数ꎮ
以上两种荧光染料只能单纯鉴定茄病镰刀菌
孢子的死或活ꎬ在同一显微视野下无法对样品中孢子死活区分开ꎬ在实践应用中存在限制ꎮ本试验对茄病镰刀菌孢子进行Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染观察ꎬ发现其能很好的区分茄病镰刀菌孢子的死活ꎬ在荧光显微视野下ꎬ活孢子发蓝色荧光ꎬ死孢子发强烈的红色荧光ꎬ凋亡孢子(处于死活之间)发蓝粉色荧光ꎮ荧光染料是一种毒性试剂ꎬ浓度过高或是染色时间过长均会对生物细胞造成伤害ꎬ导致其死亡ꎻ染色时间过短或是浓度较低会影响染色效果ꎬ发出的荧光不强烈ꎬ这些因素均会干扰试验检测计数结果[２０]ꎮ为了更好地将Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法应用于茄病镰刀菌的检测以及药剂筛选等ꎬ本研究探索出其最佳染色技术参数ꎬＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２浓度在６μｇ/ｍＬ以上ꎬ染色超过１０ｍｉｎꎬ对孢子表现出一定毒性作用ꎬ浓度１~３μｇ/ｍＬ对孢子几乎没有毒性作用ꎬ且孢子发出明亮蓝色荧光ꎬ界限清晰ꎮ综合判定Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２的最佳浓度为１μｇ/ｍＬꎬ染色２０ｍｉｎ的效果最理想ꎻＰＩ染料对孢子死活的影响较大ꎬ毒性更强ꎬ特别是浓度６μｇ/ｍＬ以上表现出明显毒性ꎬ从清晰度㊁稳定性判断３μｇ/ｍＬ为最佳浓度ꎬ染色１０ｍｉｎ即能达到较好的染色效果ꎮ
通过孢子染色比较试验ꎬ可测定不同杀菌剂对病原菌的抑制作用ꎮ施竹凤等[２１]采用台盼蓝孢子染色方法ꎬ发现１９种药剂对根肿病菌的致死效果差异明显ꎬ其中明迪㊁福帅得等药剂的致死率较高(５５.９９％~１６２.４９％)ꎬ且药剂处理时间越长孢子死亡率越高ꎮ杨玲玉等[２２]对真菌孢子进行碘化丙锭染色发现ꎬ常温条件下５０００μｇ/ｍＬ壳聚糖对灰葡萄孢(Ｂｏｔｒｙｔｉｓｃｉｎｅｒｅａ)和扩展青霉(Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍｅｘｐａｎｓｕｍ)孢子的质膜均有明显的破坏作用ꎮ本研究应用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染技术结合荧光显微镜ꎬ可快速㊁清晰㊁直观地观测到氰氨化钙对茄病镰刀菌的致死作用ꎮ试验结果表明ꎬ高浓度氰氨化钙(２０００ｍｇ/Ｌ)处理３ｈꎬ显微视野中大部分孢子呈红色荧光ꎬ致死率达８３.９７％ꎬ此时孢子几乎不萌发ꎬ说明高浓度氰氨化钙释放了大量的有毒氰氨ꎬ在短时间内就可对茄病镰刀菌孢子有致死作用ꎮ氰氨化钙５００~１０００ｍｇ/Ｌ的致死效果与处理时间呈正相关ꎬ随着处理时间延长ꎬ视野中发红色荧光的孢子增多ꎬ萌发孢子减少ꎬ处理４８ｈ时的孢子致死率高达９２.０７％~１００％ꎮ２５０ｍｇ/Ｌ氰氨化钙对茄病镰刀
３
３１㊀第２期㊀㊀贲海燕ꎬ等:利用Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２－ＰＩ荧光双染法评价氰氨化钙对茄病镰刀菌生物活性的影响
菌的致死效果微弱ꎮ㊀
室内生物测定技术是利用靶标生物等对药剂的反应来鉴别农药药效的一种手段[２３－２５]ꎮ本试验通过菌丝生长速率法㊁生物量法进一步明确了氰氨化钙对茄病镰刀菌的抑制作用ꎮ测定结果显示ꎬ１００~２５０ｍｇ/Ｌ氰氨化钙对茄病镰刀菌有一定的促进作用ꎮ崔国庆等[２６]研究表明ꎬ１００ｍｇ/Ｌ氰氨化钙对尖孢镰刀菌(Ｆ.ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ)有促进作用ꎬ２５０ｍｇ/Ｌ的抑菌效果较微弱ꎬ而１０００ｍｇ/Ｌ对尖孢镰刀菌的抑制率达到９７.０２％ꎬ与本试验结果一致ꎮ５００~３０００ｍｇ/Ｌ氰氨化钙对茄病镰刀菌的抑制效果增强ꎬ且随着处理时间延长致死率增高ꎮ本试验为拓宽氰氨化钙在植物病害防治中的作用提供了借鉴ꎬ有助于进一步指导氰氨化钙防治植物病害开展田间药效试验ꎮ
参㊀考㊀文㊀献:
[１]㊀ＤｉｘｏｎＧＲ.Ｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅ ａｓｙｎｏｐｔｉｃｒｅｖｉｅｗｏｆａｎｅｎｖｉ￣ｒｏｎｍｅｎｔａｌｌｙｂｅｎｉｇｎｆｅｒｔｉｌｉｓｅｒｗｈｉｃｈｅｎｈａｎｃｅｓｓｏｉｌｈｅａｌｔｈ[Ｊ].Ｉｎ￣ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１２ꎬ９３８:２１１－２１８.
[２]㊀ＨｅＮＺꎬＹｕＳꎬＹｅＺＱꎬｅｔａｌ.Ｅｆｆｅｃｔｏｆｌｉｍｅｎｉｔｒｏｇｅｎｏｎｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｕｒｅａｉｎｓｏｉｌｓ[Ｊ].Ｐｅｄｏｓｐｈｅｒｅꎬ１９９５ꎬ５(３):２２１－２２７.
[３]㊀邓子恒ꎬ戴林建ꎬ张惠林.施用改良剂对植烟土壤养分含量和酶活性的影响[Ｊ].湖南农业大学学报(自然科学版)ꎬ２０２０ꎬ４６(５):５８０－５８４.
[４]㊀ＳａｂａｔｉｎｏＬꎬＩａｐｉｃｈｉｎｏＧꎬＬａＢＳꎬｅｔａｌ.Ａｎａｐｐｒａｉｓａｌｏｆｃａｌｃｉ￣ｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅａｓａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅＮｓｏｕｒｃｅｆｏｒｓｐｒｉｎｇ￣ｓｕｍｍｅｒａｎｄｆａｌｌｓｅａｓｏｎｃｕｒｌｙｅｎｄｉｖｅｃｒｏｐｓ:ｅｆｆｅｃｔｓｏｎｃｒｏｐｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅꎬＮＵＥａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｑｕａｌｉｔｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ[Ｊ].Ａｇｒｏｎｏｍｙꎬ２０２０ꎬ１０(９):１３５７.
[５]㊀ＫａｚｕｋｉＳꎬＮａｏｙａＫꎬＫｏｔａＮꎬｅｔａｌ.ＩｍｐａｃｔｓｏｆａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅａｎｄｔｈｅｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｉｎｃｒｅａｓｅｉｎｓｏｉｌｐＨｏｎＮ２Ｏｅｍｉｓｓｉｏｎｓａｎｄｓｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌｃｏｍｍｕｎｉｔｙｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ[Ｊ].
ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＦｅｒｔｉｌｉｔｙｏｆＳｏｉｌｓꎬ２０２１ꎬ５７:２６９－２７９. [６]㊀ＴｒｅｍｂｌａｙＮꎬＢéｌｅｃＣꎬＣｏｕｌｏｍｂｅＪꎬｅｔａｌ.Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｃａｌｃｉ￣ｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅａｎｄｌｉｍｉｎｇｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｌｕｂｒｏｏｔｄｉｓｅａｓｅｉｎｃａｕ￣ｌｉｆｌｏｗｅｒ[Ｊ].ＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ２００５ꎬ２４(９):７９８－８０３. [７]㊀ＤｏｎａｌｄＥＣꎬＬａｗｒｅｎｃｅＪＭꎬＰｏｒｔｅｒＩＪ.Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｐａｒｔｉｃｌｅｓｉｚｅａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｏｎｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍ￣ｉｄｅｆｏｒｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｌｕｂｒｏｏｔｏｆｖｅｇｅｔａｂｌｅｂｒａｓｓｉｃａｓ[Ｊ].ＣｒｏｐＰｒｏ￣ｔｅｃｔｉｏｎꎬ２００４ꎬ２３(４):２９７－３０３.
[８]㊀杜志勇ꎬ樊小林.改性石灰氮防治香蕉枯萎病及其恢复香蕉生产的效果[Ｊ].果树学报ꎬ２００８ꎬ２５(３):３７３－３７７. [９]㊀ＣｈｏｉＨＷꎬＣｈｕｎｇＩＭꎬＭｉＨＳꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｐｅｎｔｍｕｓｈｒｏｏｍｓａｗｄｕｓｔｃｏｍｐｏｓｔｍｉｘｅｓꎬｃａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅａｎｄｓｏ￣ｌａｒｉｚａｔｉｏｎｏｎｂａｓａｌｓｔｅｍｒｏｔｏｆｔｈｅｃａｃｔｕｓＨｙｌｏｃｅｒｅｕｓｔｒｉｇｏｎｕｓ
ｃａｕｓｅｄｂｙＦｕｓａｒｉｕｍｏｘｙｓｐｏｒｕｍ[Ｊ].ＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ２００７ꎬ２６(２):１６２－１６８.
[１０]ＢｏｕｒｂｏｓＶＡꎬＳｋｏｕｄｒｉｄａｋｉｓＭＴꎬＤａｒａｋｉｓＧＡꎬｅｔａｌ.ＣａｌｃｉｕｍｃｙａｎａｍｉｄｅａｎｄｓｏｉｌｓｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｏｆＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａ￣ｎｉｆ.ｓｐ.ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅｃｕｃｕｍｂｅｒ[Ｊ].ＣｒｏｐＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ１９９７ꎬ１６(４):３８３－３８６.
[１１]ＬｉＸꎬＱｕａｎＣＳꎬＹｕＨＹꎬｅｔａｌ.ＡｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆａｎｔｉｆｕｎｇａｌｅｆｆｅｃｔｓｏｆａｎｏｖｅｌｃｏｍｐｏｕｎｄｆｒｏｍＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｃｅｐａｃｉａａｇａｉｎｓｔＦｕｓａｒｉｕｍｓｏｌａｎｉｂｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｓｔａｉｎｉｎｇ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２００９ꎬ２５(１):１５１－１５４. [１２]代京莎.北美大豆猝死综合症病菌和大豆疫病菌活性检测技术研究[Ｄ].广州:华南农业大学ꎬ２００９.
[１３]ＶｕｊａｎｏｖｉｃＳꎬＧｏｈＹＫꎬＶｕｊａｎｏｖｉｃＶ.Ｎａｔｕｒａｌｆｒｕｉｔｅｘｔｒａｃｔｓａｓｎｏｎ￣ｔｏｘｉｃｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｄｙｅｓｆｏｒｓｔａｉｎｉｎｇｆｕｎｇａｌｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅｓ[Ｊ].ＷｏｒｌｄＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ＆Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１２ꎬ２８(１):３８７－３９０.
[１４]杨玲玉.茎点霉Ｐｈｏｍａ活性及检疫性茎点霉小分子多肽检测技术研究[Ｄ].泰安:山东农业大学ꎬ２０１６.
[１５]陈念ꎬ高向阳ꎬ林壁润.万隆霉素抑制细菌的作用机理初探[Ｊ].西北农林科技大学学报(自然科学版)ꎬ２００５ꎬ３３:１４３－１４７.
[１６]马艳ꎬ李海ꎬ常志州ꎬ等.沼液对植物病害的防治效果及机理研究Ⅰ:对植物病原真菌的抑制效果及抑菌机理初探[Ｊ].农业环境科学学报ꎬ２０１１ꎬ３０(２):３６６－３７４. [１７]云宝仪ꎬ周磊ꎬ谢鲲鹏ꎬ等.黄芩素抑菌活性及其机制的初步研究[Ｊ].药学学报ꎬ２０１２ꎬ４７(１２):１５８７－１５９２. [１８]慕立义.植物化学保护研究方法[Ｍ].北京:中国农业出版社ꎬ１９９７.
[１９]ＣｈａｐｌｉｎＤＪꎬＤｕｒａｎｄＲＥꎬＯｌｉｖｅＰＬ.ＣｅｌｌｓｅｌｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍａｍｕｒｉｎｅｔｕｍｏｕｒｕｓｉｎｇｔｈｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｐｒｏｂｅＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２[Ｊ].
ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＣａｎｃｅｒꎬ１９８５ꎬ５１(４):５６９－５７２. [２０]唐丽华ꎬ王袆茜ꎬ游本刚ꎬ等.珍珠菜提取物ＺＥ４对ＳＭＭＣ－７７２１肿瘤细胞凋亡的诱导作用[Ｊ].上海中医药杂志ꎬ２０１０ꎬ４４(３):５８－６２.
[２１]施竹凤ꎬ裴卫华ꎬ王会ꎬ等.十字花科根肿病菌染色及药剂致死效果测定研究[Ｊ].西南农业学报ꎬ２０２０ꎬ３３(９):１９８４－１９９０.
[２２]杨玲玉ꎬ孟祥红ꎬ刘成圣ꎬ等.壳聚糖的抗菌性及其对果实病害的防治研究进展[Ｊ].中国农业科学ꎬ２００９ꎬ４２(２):６２６－６３５.
[２３]吴翠霞ꎬ王金信ꎬ侯珍ꎬ等.白藜芦醇及其衍生物对植物病原真菌的抑菌活性[Ｊ].农药学学报ꎬ２０１２ꎬ１４(３):２８３－
２９０.
[２４]霍建飞ꎬ郝永娟ꎬ杨秀荣ꎬ等.番茄漆斑病病原鉴定及防治药剂室内活性筛选[Ｊ].西南农业学报ꎬ２０１９ꎬ３２(６):１２９６－１３０１.
[２５]魏敏ꎬ于淑晶ꎬ丁国华ꎬ等.姜黄炭疽病的病原菌鉴定及杀菌剂对其室内生物活性测定[Ｊ].农药ꎬ２０２０ꎬ５９(６):４５５－４５８.
[２６]崔国庆ꎬ李宝聚ꎬ石延霞ꎬ等.石灰氮土壤改良作用及病虫害防治效果[Ｊ].植物保护ꎬ２００６ꎬ３２(６):１４５－１４７.
４３１㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀山东农业科学㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第５５卷㊀。