五章体内药物分析

衍生化方法：柱前衍生， 柱后衍生
气相色谱衍生化方法：硅烷化、酰化、烷基化、不对称衍生化 液相色谱衍生化方法：紫外衍生化、荧光衍生化、电化学衍生
化、手性衍生化
第三节、体内样品分析方法与方法验证
一、分析方法的建立 （一）、分析方法的选择 1、色谱分析法 2、免疫分析法 3、生物学方法
常用分析方法的特点
浓集：常用吹氮气使溶剂挥散，或减压蒸发（注意暴沸）。
生物样品宜在碱性或近中 性提取，生物基质中内源 性物质多为酸性，在碱性 下不易被萃取出来。
空白血清在pH2、pH7和 pH13三种缓冲液中用乙醚提 取，提取液HPLC(220nm)测 定，在pH13下提取液中杂质 峰最少。
液液萃取特点： ➢ 优点：可将大部分内源性杂质去除；经济实用、
抗凝剂—最常用的是肝素（heparin），肝素是体内正常 成分，因此不会改变血样的化学组成或引起药物的变化， 一般不会干扰药物的测定。通常1ml血液需用肝素 0.10.2mg或20IU(1mg126IU)。可不必准确控制
其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等，是与血液中 的钙离子结合的试剂，它们可能引起被测组分发生变化或 干扰某些药物的测定，不常使用。
生物样品特点
1、被测定的药物和代谢物的浓度低； 2、样品大多需要分离和净化； 3、样品量少，连续测定时，很难再度获得完全相同
的样品。 4、工作量较大， 5、要求很快地提供结果(毒物检测)
体内药物分析：
样品制备：去除蛋白质、缀合物水解、化学衍生 化、分离浓集（液液萃取、固相萃取等）； 样品测定：光谱分析法、色谱分析法、免疫分析 法、生物学方法 方法验证：特异性、标准曲线和定量范围、定量 下限、精密度与准确度、稳定性、提取回收率
化合物名称
极性
Hexane(正己烷)
0.06
Cyclohexane(环己烷)
0.1
Toluene(甲苯)
2.4
Ethyl ether(乙醚)
2.9
Methylene chloride(二氯甲烷) 3.4
Ethyl acetate（乙酸乙酯） 4.30
Chloroform(氯仿)
4.4
粘度
0.33 1 0.59 0.23 0.44 0.45 0.57
第一节、常用体内样品的制备与贮藏
一、体内样品的种类、采集与制备
（一）血样：血浆、血清 血浆：选用最多。因血浆中的药浓可反映药物在体内的状
况。而且血浆中药物浓度的数据报道较多，可供借鉴。血 浆是全血在加肝素、枸橼酸、草酸盐等抗凝剂的全血经离 心后分取，量约为全血的一半。
血浆的制备：采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混 合后，以25003000r/min离心510min使与血球分离， 所得淡黄色上清液即为血浆。
沸点
69 81 111 35 40 77 61
吸收波长
210 210 285 220 245 260 245
22
提取溶剂：极性相似相溶
溶剂的用量：一般有机相与水相之比为1：1~5：1 溶液的pH调节：最佳pH选择主要与药物的pKa值有关。酸性
药物pH应低于药物pKa值1~2个单位；碱性药物：pH应高 于药物pKa值1~2个单位。 提取：进行一次（至多二次）提取，
成人一日排尿量为15L。尿样包括随时尿、晨尿、白 天尿、夜间尿及时间尿几种。因尿液浓度变化较大，所 以应测定一定时间内排入尿中的药物总量。一般采集时 间尿（规定时间内采集尿液体积和排入尿中的药物总 量）。
尿液中药物浓度的改变不能直接反映血药浓度，即与血 药浓度相关性较差、尿液量较大不易保存等。
（三）、唾液：
3、加入强酸 与蛋白形成沉淀，阴离子型沉淀剂。如三氯醋酸、高氯酸、 偏磷酸等，在酸性下分解的药物不宜用本法去蛋白。
4、热凝固法 加热至90℃蛋白热变性后离心或过滤除去
（二）分离、纯化与浓集 当药物浓度较低或分析方法的特异性或灵敏度不 够高时，生物样品需分离、纯化与浓集。
1、液相萃取法
溶剂选择—合适的溶剂是成功的主要条件 ①了解药物与溶剂的化学结构及其性质 ②对药物未电离分子可溶，对电离形式分子不溶 ③沸点低、易挥发，毒性小与水不相混溶 ④不影响紫外检测 ⑤具有较高的化学稳定性和惰性 ⑥不易乳化
可使样品富集、可一次进行多个样品萃取 ➢ 缺点：乳化、污染环境、
乳化的去除：加少量固体氯化钠到水相中可减 轻乳化；轻微乳化离心；严重乳化低相萃取法：
以固相分离方法进行样品预处理，从水相中分离 出所需测定的组份，通常以柱分离方式进行操作， 故有时这种方法又称为固相提取
空白溶剂试验 ——溶剂(方法特异性) 空白生物基质试验 —— 内源性物质干扰(方法特异性) 模拟生物样品试验 —— 方法验证（效能指标）
3、实际生物样品测试
二、分析方法的验证
1．特异性——避免干扰 2．标准曲线与线性范围 3．定量限——灵敏度 4．精密度与准确度——结果可重现 5．样品稳定性 6．提取回收率 7．分析过程的质量控制
血清的制备：采集的静脉血液置试管中，于37℃或室温 放置30min1h。血液凝固后，用细竹棒或玻璃棒轻轻 剥去试管壁上的血饼，再在25003000 r/min离心 510min，上层淡黄色液体即为血清。
现文献所指血药浓度为血浆或血清中药物总浓度（游离 的和血浆蛋白结合的总浓度）。
血浆与血清的区别
生物大分子物质。可加压过滤或高速离心。
（三）、辍合物的水解：
酸水解法：强酸、加热 酶解：常用葡萄糖醛酸酶，一般控制pH4.5~5.5 ，
37℃孵育数小时。 溶剂解：
（四）、化学衍生化
1、使药物变成能被分析的性质 2、提高检测灵敏度 3、增强药物稳定性 4、提高对光学异构体分离的能力 ➢ 气相色谱衍生化 ➢ 液相色谱衍生化
头发样品的洗涤：除去外源性污染物，推荐使用丙酮-水-丙 酮；丙酮浸泡搅拌10min，自来水漂洗3次，再用丙酮浸 泡搅拌，自来水、蒸馏水各洗3次。
头发样品的处理：直接甲醇提取、酸水解、碱水解、酶水解 （葡萄糖醛酸酶）
三、体内样品的贮存与处理
（一）冷藏与冷冻
血浆和血清需采集后及时分离，一般最迟不超过2h，分离后 再置冰箱或冷冻柜中保存（-20~-80℃）。 尿样应立即测定，若收集24h的尿液不能立即测定时，可加入 甲苯、氯仿、醋酸等防腐剂，一般可保存24~36h，也可加入 叠氮化钠较长时间保存。
体外药物分析
准确度 精密度 专属性 检测限 定量限 线性 范围 耐用性
（一）、方法特异性(专属性或选择性)
方法的特异性(specificity) ——又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用 ——系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性——表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有的 选择性——系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区
1～10 0.1～0.01
0.01 0.001
10 0.1 0.01～0.001 0.001
++ +++ +++ ++++
++ +++ +++ ++++
免疫法（RIA） 酶免疫法（EIA） 放射免疫
0.001
++
0.001
++
（二）、分析方法建立的一般程序 1、色谱条件的筛选：确定最佳分析检测条件；色谱柱(型号、
（四）组织：
药物在脏器组织中的分布情况，常用胃、肝、肾、 肺、心等。 制备：测定之前一般需制成匀浆 组织样品的处理：沉淀蛋白法、酸水解法、酶水 解法 （蛋白水解酶）
（五）头发：
应用— 体内微量元素含量测定 — 用药史的估计 — 临床用药和药物非法滥用的区别 — 毒性药物检测
头发样品的采集：采集枕部发样(带根部），微量元素在前 额部位的头发中含量最低，枕部含量最高。
牌号、填料性质、柱长度)；流动相组分及配比、流速、柱温、 进样量、内标物质的浓度及其加入量等；使各物质具有足够
的方法灵敏度(LOQ)；良好的色谱参数(n、R、T)和适当的保
留时间(tR)。
2、色谱条件的优化：
在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物 质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：
唾液在保存过程中会放出二氧化碳使pH值升高。另唾液中含 有粘蛋白，须离心后冷藏或冷冻
（二）去活性
终止酶的活性方法：快速冷冻、微波照射、加入酶活性阻断 剂等。
第二节、体内样品的的前处理
分析方法与样品处理步骤的选择
一、体内样品预处理的目的 1、使药物从缀合物及结合物中释放出来，以测定药物的总
浓度。 2、介质复杂，干扰物多，待测物浓度低，须分离干扰物质、
唾液中的药物浓度通常与血浆浓度相关。样品易得， 取样无损害，尤易为儿童接收。有些可从药物唾液浓度推 定血浆中游离药物浓度。
唾液由腮腺、颌下腺和舌下腺三个主要的唾液腺分泌汇 集而成前两者分泌量占总量90%。两者中浓度大致相当。
取样：在潄口后15min，安静状态下采集口腔内然流出 的唾液；也可在刺激下快速采样(需注意干扰) 。如口嚼石 腊片或将柠檬酸、维生素C等置于舌尖，弃去初始部分后 采集。刺激后采集的为混合唾液。
活化上样淋洗洗脱 洗脱液浓集
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固相萃取的模式及原理
反相固相萃取
正相固相萃取 离子交换固相萃取
① 阴离子交换 ② 阳离子交换
实验步骤
第一步：用甲醇润湿小柱，活化填料 第二步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱 —除去大部分甲醇 第三步：加样，使样品经过小柱，弃去废液 第四步：用水或适当的缓冲液冲洗小柱，去除内源性杂质 第五步：选择适当的洗脱溶剂洗脱被分析物，收集洗脱液，挥 干溶剂，备用或直接进行在线分析
分析方法
紫外分光光度法（UV）
荧光分光光度法（Fluor） 原子吸收光度法（AA）
检测限度/10-8g/ml
100 0.1 0.1
特异性/分离能力
－
+
+
气相色谱法（GC） 氢火焰离子化检测器（FID） 氮磷检测器（N-PD） 电子捕获检测器（ECD） 质谱检测（MS）
高效液相色谱法（HPLC） 紫外检测器（UV） 荧光检测器（Fluor） 电化学检测器（ECD） 质谱检测
用两个或两个以上柱子连接构成色谱网络系统，使不 同柱子达到不同分离目标，柱子间用切换阀联结，这就是 柱切换技术。 基本原理是首先在预柱上实现生物体液中干扰大分子与待测药 物的分离，然后用柱切换将待测药物从预柱转移至分析柱 上完成色谱分析。
3. 超滤法 膜分离技术，可用于测定生物样品中游离药物浓度 按照分子截留量的大小，可分离301000kD的可溶性
血清比血浆只是少一种纤维蛋白原 一般血浆中药物浓度与血清中药物浓度相当 血浆比血清的分离快，而且制取量约为全血的50%~60%
（血清为全血的50%左右），多数用血浆进行分析。 若血浆中含有的抗凝剂对药物浓度测定有影响时，则应
使用血清样品 。
（二）尿样：
尿样测定主要用于药物剂量回收研究、药物肾清除率和生 物利用度等研究，以及测定代谢物类型等。体内药物清除 主要是通过尿液排出，药物可以原型（母体药物）或代谢 物及其缀合物形式排出。尿样常需加入防腐剂。
血浆样品可直接上柱，样品量0.1~2ml，流速1~2ml/min
本法特点：少溶剂、少污染、减少液液萃取的乳化。 适合各种液体检材如血、尿、洗胃液、现场水、饮 料等，对于肝、肾、胃以及其他固体检材，均需制 成水液方可进行固相萃取。
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自动化固相萃取-柱切换高效液相色谱法
柱切换高效液相色谱技术是指由阀来改变流动相走向与 流动相系统，从而使洗脱液在一特定时间内从预处理柱进 入分析柱的技术。
分(分离)的能力
考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几 点：1. 内源性物质的干扰比较——待测药物或其活性 代谢产物检测信号；2. 代谢产物的干扰比较——模拟 生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号；3. 伍 用药物的干扰还要考虑患者可能同时服用药物(通常为 数有限)的干扰。提供三张色谱图，空白生物样品图、 空白加对照、实际生物样品图；4.与参比方法的相关性
富集待测药毒物 3、为了适应和符合测定方法所要求的灵敏度 4、为了防止分析仪器的污染、劣化，提高检测准确度、精
密度和选择性等。
二、常用体内样品预处理方法 要考虑：药物的理化性质（极性、酸碱性、光谱特 性、挥发性、稳定性），药物测定的目的，选用的 生物体液和组织的类型，待测物的浓度范围，样品 制备与分析技术的关系。
（一）、去除蛋白质
是测定血浆、血清、全血及组织匀浆等样品中药物时的 最先处理步骤。 1、加入可与水混溶的有机溶剂（体积比、pH值） 破坏蛋白质分子内及分子间的氢键。常加入乙腈、甲醇、 乙醇等，能使与蛋白结合状态的药物释放，将混合物超 速离心，取上清液作为样品。
2、加入中性盐 使蛋白脱水而沉淀，硫酸铵最常用