低氧促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移的机制

低氧促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移的机制
金家豪１，２，赵宝生１，２，刘玉珍１
，２△
（１．新乡医学院第一附属医院胸外科，２．新乡医学院第一附属医院生命科学研究中心，河南卫辉４５３１００）
【摘要】　目的：探讨低氧促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移的机制。

方法：培养肺腺癌Ａ５４９细胞，转染慢病毒获得稳定敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞株，转染ｓｉ ＲＮＡ获得敲低ＳＲＥＢＰ １的Ａ５４９细胞。

分别以低氧（５％Ｏ２）联合低氧诱导因子１α（ＨＩＦ １α）抑制剂ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）处理Ａ５４９细胞，低氧联合亚油酸（ＬＡ）（２０μｍｏｌ）处理敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞，低氧处理敲低胆固醇调节原件结合蛋白１（ＳＲＥＢＰ １）的Ａ５４９细胞。

Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测细胞迁移，蛋白质印迹法检测ＨＩＦ １α、ＡＣＣ１及上皮 间质转化（ＥＭＴ）相关波形蛋白（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ）及Ｅ 钙黏蛋白（Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ）的表达与ＳＲＥＢＰ １的表达，实时荧光定量聚合酶链反应（ＲＴ ｑＰＣＲ）检测低氧联合ＨＩＦ １α抑制剂ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）处理Ａ５４９细胞后ＡＣＣ１及ＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ水平变化。

每项实验重复三次。

结果：与常氧组相比，低氧组Ａ５４９细胞迁移数增加，ＡＣＣ１与ＨＩＦ １α表达上调（Ｐ均＜０．０１），ＳＲＥＢＰ １表达上调（Ｐ＜０．０５）；与低氧对照组相比，ＰＸ ４７８（２５μ
ｍｏｌ）抑制Ａ５４９细胞迁移，ＳＲＥＢＰ １表达下调（Ｐ＜０．０５）；低氧处理Ａ５４９细胞后ＡＣＣ１ｍＲＮＡ上升（Ｐ＜０．０５），ＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ水平上升（Ｐ＜０．０１）；低氧并使用ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）处理Ａ５４９细胞２４ｈ，ＡＣＣ１ｍＲＮＡ水平下降（Ｐ＜０．０５），ＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ水平下降（Ｐ＜０．０１）；转染ｓｉ ＲＮＡ获得敲低ＳＲＥＢＰ １的Ａ５４９细胞，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验显示ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组细胞迁移数较常氧对照组减少（Ｐ＜０．０１）；低氧处理ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组与ｓｉ ＮＣ组，与对照组相比ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组细胞迁移数减少（Ｐ＜０．０１）但与常氧组相比差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组ＡＣＣ１表达较对照组下降（Ｐ＜０．０１）；低氧处理ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组，ＡＣＣ１表达较对照组下降（Ｐ＜０．０１）；敲低ＡＣＣ１抑制Ａ５４９细胞迁移（Ｐ＜０．０５），敲低ＡＣＣ１后Ａ５４９细胞在常氧和５％Ｏ２条件下细胞迁移数目差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；低氧处理敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞并给予ＬＡ（２５μｍｏｌ）促进Ａ５４９细胞迁移（Ｐ＜０．０５）。

结论：低氧通过ＨＩＦ １α
／ＳＲＥＢＰ １／ＡＣＣ１途径调节脂肪酸代谢进而促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移。

【关键词】　肺腺癌；低氧；乙酰辅酶Ａ羧化酶１；低氧诱导因子１α；固醇调节元件结合蛋白１；迁移【中图分类号】Ｒ７３４ ２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２２）０１ ０６８ ００８【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．６２００．２０２２．０１３
Ｒｅｓｅａｒｃｈｏｎｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｈｙｐｏｘｉａｐｒｏｍｏｔｉｎｇｔｈｅ
ｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＡ５４９ｃｅｌｌｓ
ＪＩＮＪｉａ ｈａｏ１，２，ＺＨＡＯＢａｏ ｓｈｅｎｇ１，２，ＬＩＵＹｕ ｚｈｅｎ
１，２△
（１．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＴｈｏｒａｃｉｃＳｕｒｇｅｒｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉｎｘｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ；２．ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒ，
ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＸｉｎｘｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｅｉｈｕｉ４５３１００，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｔｈａｔｈｙｐｏｘｉａｐｒｏｍｏｔｅｓｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＡ５４９ｃｅｌｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ５４９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄａｎｄｃｅｌｌｓｔｈａｔｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆａｃｅｔｙｌ ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ１（ＡＣＣ１）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ，ａｎｄｃｅｌｌｓｔｈａｔｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｓｔｅｒｏｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｓ １（ＳＲＥＢＰ １）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｓｉ ＲＮＡ．Ａ５４９ｃｅｌｌｓｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｙｐｏｘｉａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ １α（ＨＩＦ １α）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）；Ｈｙｐｏｘｉａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄ（ＬＡ）（２０μｍｏｌ）ｔｒｅａｔｅｄＡ５４９ｃｅｌｌｓｗｉｔｈＡＣＣ１ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ，ａｎｄＡ５４９ｃｅｌｌｓｗｉｔｈＳＲＥＢＰ １ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａ．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔＨＩＦ １α，ＡＣＣ１ａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ（ＥＭＴ）ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ，Ｅ ＣａｄｈｅｒｉｎａｎｄＳＲＥＢＰ １；Ｒｅａｌ ｔｉｍｅｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ ｑＰＣＲ）ｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｃｈａｎｇｅｓｏｆＡＣＣ１ａｎｄＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｈｙｐｏｘｉａａｎｄＨＩＦ １αｉｎｈｉｂｉｔｏｒＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｅａｃｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｗａｓｒｅｐｅａｔｅｄｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍｏｘｉｃｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｈｙｐｏｘｉａｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０１），ａｎｄｕｐ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＡＣＣ１，ＨＩＦ １α（
ａｌｌＰ＜０．０１）ａｎｄＳＲＥＢＰ １（Ｐ＜０．０５）．ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｙｐｏｘｉａａｎｄｄｏｗｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＲＥＢＰ １（ａｌｌＰ＜０．０５）．ＡＣＣ１ｍＲＮＡａｎｄＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡｌｅｖｅｌｓｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｈｙｐｏｘｉａｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ（ａｌｌＰ＜０．０５）．ＴｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆＡＣＣ１ｍＲＮＡａｎｄＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡｗｅｒｅｄｅｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒＡ５４９ｃｅｌｌｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｙｐｏｘｉａｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）ｆｏｒ２４ｈ（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１）．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＳＲＥＢＰ １ｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｗｉｔｈｓｉ ＲＮＡ．Ｔｒａｎｓｗｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｓｉ ＳＲＥＢＰ １ｇｒｏｕｐｗａｓｌｅｓｓｔｈａｎｔｈａｔｉｎｎｏｒｍｏｘｉａｃｏｎ ｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｔｈｅｓｉ ＳＲＥＢＰ １ｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｓｉ ＮＣｇｒｏｕｐｗｅｒｅｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｙｐｏｘｉａ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅ
８６ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２２，３８（１）
ｎｕｍｂｅｒｏｆｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｓｉ ＳＲＥＢＰ １ｇｒｏｕｐｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜０．０１），ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｎｏｔｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｎｏｒｍｏｘｉａｓｉ ＳＲＥＢＰ １ｇｒｏｕｐ（Ｐ＞０．０５）．ＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＣ１ｉｎｔｈｅｓｉ ＳＲＥＢＰ １ｇｒｏｕｐｗａｓｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（Ｐ＜０．０１）．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＡＣＣ１ｗａｓｄｅｃｒｅａｓｅｄａｆｔｅｒｓｉ ＳＲＥＢＰ １ｇｒｏｕｐｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｈｙｐｏｘｉａ（Ｐ＜０．０１）．ＫｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＡＣＣ１ｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ（Ｐ＜０．０５）．Ａｆｔｅｒｋｎｏｃｋ ｄｏｗｎｏｆＡＣＣ１，ｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｎｕｍｂｅｒｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｎｏｒｍｏｘｉａａｎｄ５％Ｏ２ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＞０．０５）．ＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬＡｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｒｅｓｃｕｅｄＡＣＣ１ ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｉｎｄｕｃｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎｈｙｐｏｘｉａ ｐｒｏｍｏｔｅｄＡ５４９ｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＨｙｐｏｘｉａｐｒｏｍｏｔｅｓｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａＡ５４９ｃｅｌｌｓｂｙｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｆａｔｔｙａｃｉｄｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｔｈｒｏｕｇｈＨＩＦ １α
／ＳＲＥＢＰ １／ＡＣＣ１ｐａｔｈｗａｙ．【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ；　ｈｙｐｏｘｉａ；　ａｃｅｔｙｌ ＣｏＡｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ１；　ｈｙｐｏｘｉａｉｎｄｕｃｉｂｌｅｆａｃｔｏｒ１α；　ｓｔｅｒｏｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１
；　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ 【基金项目】河南省重点科技攻关项目（２０２１０２３１０１０３）；新乡
医学院研究生科研创新支持计划项目（ＹＪＳＣＸ２０１９１４Ｚ）；新乡市科技攻关计划项目（ＧＧ２０２００２７）【收稿日期】２０２１ ０４ ０７【修回日期】２０２１ １２ ２７　△【通讯作者】Ｔｅｌ：０３７３ ４４０３９２３；Ｅ ｍａｉｌ：ｙｕｚｈｅｎｌｉｕ＠ｘｘｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
肺癌是我国发病率和死亡率均居第一位的对人
类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一［１］。

近年
来，中国肺癌的发病率逐年升高，尽管目前外科手术和放化疗技术已取得显著进展，并且靶向药物也在不断更新，但由于肺癌病程进展快加之其高转移性，
导致肺癌患者五年生存率普遍较低［２］。

目前对肺
腺癌转移缺乏有效治疗方法，因此阐明肺腺癌细胞在低氧条件下迁移的机制对于治疗肺腺癌、提高患者生存率十分必要。

肿瘤细胞远高于普通细胞的能量需求注定了其具有特殊的能量代谢途径。

与正常细胞相比，肿瘤组织的能量供应更依赖于增加内源性脂质的生
成［３］
，脂质代谢在肿瘤细胞的发生发展过程中发挥重要作用［
４］。

低氧影响脂肪酸代谢，通过调控多个相关酶改变肿瘤细胞代谢进程［５］。

低氧对于肺癌的进展尤其是转移具有重要的影响［６］，低氧的直接效应因子ＨＩＦ １α在肺癌组织的坏死区域含量高［３］并被证实与肿瘤转移的不良预后相关［７］，ＡＣＣ１是
脂肪酸合成的限速酶，本课题组的前期研究发现低氧处理肺腺癌Ａ５４９细胞会促进其迁移并上调ＡＣＣ１表达，影响ＥＭＴ相关蛋白Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ与Ｖｉｍ
ｅｎｔｉｎ的表达［８］，但低氧如何调控ＡＣＣ１并促进Ａ５４９
细胞迁移，相关机制尚不明确。

本研究旨在探讨低氧在肺腺癌细胞中上调ＡＣＣ１表达的机制及低氧通过上调ＡＣＣ１促进肺腺癌细胞迁移的机制。

本研究通过使用ＨＩＦ １α抑制剂及ＲＮＡ干扰技术先后抑制ＨＩＦ １α作用，并分别敲低ＡＣＣ１、ＳＲＥＢＰ １，观察低氧对于Ａ５４９细胞迁移的影响，进一步探讨低氧促进Ａ５４９细胞迁移的分子机制，为探索肺腺癌新的
治疗靶点提供新的理论依据。

１　材料与方法
１．１　材料
人肺腺癌细胞Ａ５４９购于上海吉凯基因化学技术有限公司。

采用含１０％胎牛血清、１００Ｕ／ｍｌ青链霉素、１００ｍｇ／ｍｌ青链霉素的ＤＭＥＭ培养基，置于３７℃、５％ＣＯ２、饱和湿度培养箱内培养。

１．２　主要试剂和抗体
胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）购自Ｃｌａｒｋ，ＤＭＥＭ培养基购自Ｃｏｍｉｎｇ；青链霉素购自北京索莱宝科技有限公司，慢病毒ＡＣＣ１ ｓｈＲＮＡ及对照ｓｈＲ ＮＡ由上海吉玛基因生物公司合成；ＰＸ ４７８购自美国Ａ
ＰＥｘＢＩＯ公司，ＬＡ购自碧云天，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购自美国Ｃｏｒｎｉｎｇ公司；用以敲减ＳＲＥＢＰ １的ｓｉ ＲＮＡ序列（５＇ ＣＵＣＣＵＧＣＵＵＧＡＧＵＵＵＣＵＧＧＴＴ ３＇）由上海吉玛基因公司合成，ＰＣＲ试剂盒ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ Ｒｅ ｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ与ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ ＳＹＢＲ ＧｒｅｅｎＰＣＲＫｉｔ购自ＱＩＡＧＥＮ公司，兔源单克隆抗体Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ（１∶１０００）购自ＣＳＴ公司，兔源多克隆抗体ＡＣＣ１（１∶１０００）购自ＣＳＴ公司，兔源多克隆抗体Ｖｉｍｅｎｔｉｎ（１∶１０００）、ＳＲＥＢＰ １（１∶１０００）抗体购自万类生物技术有限公司，兔源多克隆抗体ＨＩＦ １α（１∶１０００）购自Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ公司，兔源多克隆抗体β
ａｃｔｉｎ（１∶１０００）购自武汉博士德公司。

辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔ＩｇＧ（１∶８０００）二抗购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司，Ｐ００１８Ｍ超敏化学发光试剂盒（ｅｎｈａｎｃｅｄｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ，ＥＣＬ）购自上海碧云天生物技术公司。

１．３　主要仪器
低氧小室购自ＳＴＥＭＣＥＬＬ（Ｃａｔａｌｏｇ＃２７３１０），ＳＷ ＣＪ ２Ｄ层流超净台购自中国苏州净化公司，Ｓｃｉ ｅｎｔｉｆｉｃ１３８５生物安全柜购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司，５５ｉＤＳ Ｆｉｌｃ倒置显微镜及成像系统购自日本Ｎｉｋｏｎ公
司，ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ实时荧光定量聚合酶链反应（ｒｅａｌ
９
６中国应用生理学杂志，２０２２，３８（１）
ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＲＴ
ｑＰＣＲ）系统购自美国Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司，Ｍｕｌｔｉ ｓｋａｎＳｐｅｃｔｒｕｍ酶标仪购自美国Ｔｈｅｒｍｏ公司，蛋白电泳、转印仪均购自美国Ｂｉｏ Ｒａｄ公司。

１．４　细胞培养
将Ａ５４９接种在含１０％胎牛血清和１％青链霉素的ＤＭＥＭ培养皿中，置于３７℃、５％ＣＯ
２
的培养箱内培养，每２．５ｄ传代一次，细胞呈单层贴壁生长。

１．５　慢病毒转染
常规培养细胞，获得２小皿（每皿２×１０５ｃｅｌｌｓ）Ａ５４９细胞。

３７℃培养箱培养３６ｈ，取出待用。

取１．５ｍｌ离心管２个，各加入５００μｌＤＭＥＭ完全培养基及５００μｌＤＭＥＭ基本培养基，分别加入Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ各１．６μｌ，关掉风机，ＥＰ管中加入提前分装好的ＡＣＣ１ ｓｈＲＮＡ及对照ｓｈＲＮＡ，混匀静置５ｍｉｎ，打开风机。

用ＰＢＳ冲洗细胞２遍，每皿加入１ｍｌ病毒，放入３７℃恒温培养箱。

６ｈ后每皿各加１ｍｌＤＭＥＭ完全培养基，次日每皿加嘌呤霉素４μｌ，待细胞长满后检测ＡＣＣ１是否敲低。

数次筛选后培养出稳定敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞系。

１．６　ｓｉＲＮＡ转染方法
细胞接种于小皿中，待融合度达到３５％后进行转染。

采用Ｌｉｐｏ２０００细胞转染试剂盒，按照说明书进行转染。

设置对照组（ＮＣ，空白细胞）与敲减组，细胞转染４８ｈ后，进行后续Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞迁移实验及蛋白质免疫印迹实验。

１．７　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ细胞迁移实验
将Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室放入２４孔板内，用不含胎牛血清的培养基制备细胞悬液，调整浓度为２×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ，取２００μｌ（含细胞数４×１０４）加入Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上室，２４孔板下室加入６００μｌ含胎牛血清的培养基，将常氧对照组置于３７℃培养箱中培养２４ｈ，将
低氧组２４孔板放入５％Ｏ
２
的专用低氧装置中，置于３７℃培养箱中培养２４ｈ后取出小室；采用４％的多聚甲醇固定１５ｍｉｎ后０．１％结晶紫染色８ｍｉｎ，棉签擦去上室内的细胞。

显微镜下每孔选取５个视野在１０倍镜下进行拍照计数，取平均值表示细胞的迁移数目；同样方法检测亚油酸（ＬＡ）处理后ｓｈ ＮＣ及ｓｈ ＡＣＣ１组迁移的变化。

１．８　Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测相关蛋白的表达
检测低氧处理以及低氧处理并加入ＨＩＦ １α抑制剂ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）后Ａ５４９细胞ＨＩＦ １α、ＳＲＥＢＰ １、ＡＣＣ１、Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达变化，检测常氧及低氧条件下分别给予ｓｈ ＮＣ与ｓｈ ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞以ＬＡ（２０μｍｏｌ）处理后Ｅ ｃａｄ ｈｅｒｉｎ与Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达变化；将处于对数生长期的细胞按照分组进行处理３６ｈ，用放射免疫沉淀法（ＲＩＰＡ）裂解细胞后提取细胞总蛋白，通过ＢＣＡ法测定蛋白浓度（根据ＢＣＡ试剂盒说明书进行操作）。

以每组３０μｇ的等量蛋白样品上样，用１０％的十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电脉（ＳＤＳ ＰＡＧＥ）分离蛋白，转膜，再用５％的脱脂奶粉在常温下封闭１ｈ，加入ＡＣＣ１、Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ等一抗４℃过夜，用ＴＢＳＴ洗膜后（１０ｍｉｎ×３次），加入辣根过氧化物酶标记兔抗ＩｇＧ（１∶８０００）室温摇床上孵育１ｈ，再洗膜３０ｍｉｎ，除去未结合的二抗，最后根据说明书按照１∶１配置ＥＣＬ工作液，用凝胶成像仪成像；利用计算机软件ＩｍａｇｅＪ（版本号：Ｖ１．４８）进行灰度值分析。

１．９　实时荧光ＰＣＲ检测相关ｍＲＮＡ的表达分别收集经常氧，５％Ｏ
２
，常氧＋ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）及５％Ｏ２＋ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）处理２４ｈ后的Ａ５４９细胞，采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取细胞总ＲＮＡ，通过ＱＵＡＮＴ逆转录试剂盒将总ＲＮＡ逆转录为ｃＤＮＡ。

所需引物由吉凯基因公司合成，引物序列见表１。

采用ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭＲＴ ｑＰＣＲ系统，以ＳＹＢＲ１法检测ＡＣＣ１与ＳＲＥＢＰ １表达水平，β ａｃｔｉｎ作为内参，得到扩增曲线和Ｃｔ值，应用２ ΔΔＣｔ法分析基因相对表达量。

基因相对表达量＝２ ΔΔＣｔ，其中ΔΔＣｔ＝（待测组目的基因平均Ｃｔ值－待测组管家基因平均Ｃｔ值）－（对照组目的基因平均Ｃｔ值－对照组管家基因平均Ｃｔ值）。

Ｔａｂ．１　ＲＴ ｑＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ＮａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｐｒｉｍｅｒ
ｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
Ｐｒｏｄｕｃｔ
ｌｅｎｇｔｈ（ｂｐ）
ＡＣＣ１５＇ ＡＴＣＣＣＧＴＡＣＣＴＴＣＴＴＣＴＡＣＴＧ ３＇
５＇ ＣＣＣＡＡＡＣＡＴＡＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧ ３＇
２１
２１
１６４
ＳＲＥＢＰ １５＇ ＣＧＧＡＡＣＣＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＣＡＧＴ ３＇
５＇ ＣＧＣＴＴＣＴＣＡＡＴＧＧＣＧＴＴＧＴ ３＇
２１
１９
１４１
β ａｃｔｉｎ５＇ ＣＴＴＣＧＣＧＧＧＣＧＡＣＧＡＴ ３＇
５＇ ＣＣＡＣＡＴＡＧＧＡＡＴＣＣＴＴＣＴＧＡＣＣ ３＇
１６
２２
１０４
０
７ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２２，３８（１）
１．１０　低氧小室低氧处理细胞
按照说明书进行，具体步骤简要如下：打开低氧小室的进气口和出气口，将进气端口Ｔｙｇｏｎ 管连接到含有５％Ｏ２ ５％ＣＯ２ ９０％Ｎ２混合气的气源，以２
０Ｌ／ｍｉｎ的速度吹扫腔室５ｍｉｎ，随后在断开气源的同时迅速关闭进气口与出气口环形夹，密封腔室后置于常规的ＣＯ２培养箱中培养２４ｈ。

低氧处理结束后，将低氧小室取出，打开出气口环形夹时若能听到“噗”的放气声音，说明小室未漏气，低氧处理成功。

１．１１　统计学处理
数据均采用ＳＰＳＳ２２．０软件进行分析。

所有实验结果均为计量资料，均通过正态性检验（Ｓｈａｐｉｒｏ Ｗｉｌｋ法）以均值±标准差（珋ｘ±ｓ）表示。

多组间均值差异比较采用两因素的析因方差分析，两独立组比较采用成组ｔ检验。

２　结果
２．１　低氧通过ＨＩＦ １α对Ａ
５４９细胞迁移的影响常氧及５％Ｏ２分别处理Ａ５４９细胞，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到Ａ５４９细胞低氧处理后上调ＨＩＦ １α与ＡＣＣ１表达（Ｐ均＜０．０１）；与常氧组相比，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验显示低氧处理促进Ａ５４９细胞迁移（１７５．０±７．３ｖｓ２４５．０±１１．２，Ｐ＜０．０１）；给予Ａ５４９细胞低氧并给予ＨＩＦ １α抑制剂ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ），与低氧组相比，加入ＨＩＦ １α抑制剂ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）后，抑制低氧对Ａ５４９细胞的促迁作用（２４５．０±１１．２ｖｓ２０３．０±１０．３，Ｐ＜０．０５，图１，表２）。

Ｆｉｇ．１　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈｙｐｏｘｉａｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｖｉａ
ＨＩＦ １α
Ａ：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｈｙｐｏｘｉａａｎｄＨＩＦ １αｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｔｒａｎｓｗｅｌｌｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（ｔｈｅｓｃａｌｅｗａｓ２００μｍ）；Ｂ：ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｂａｎｄｓｏｆＨＩＦ １αａｎｄＡＣＣ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｈｙｐｏｘｉａｔｒｅａｔｍｅｎｔ
２．２　低氧通过ＨＩＦ １α对Ａ５４９细胞ＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ水平与ＡＣＣ１ｍＲＮＡ水平的影响
常氧及５％Ｏ２分别处理Ａ
５４９细胞；ＰＣＲ检测到低氧处理后Ａ
５４９细胞ＡＣＣ１ｍＲＮＡ上升（Ｐ＜０．０５），ＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ上升（Ｐ＜０．０１）；低氧并使用ＰＸ ４７８处理Ａ５４９细胞２４ｈ后，Ａ５４９细胞ＡＣＣ１ｍＲＮＡ水平较低氧对照组下降（Ｐ＜０．０５），ＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ水平较低氧对照组下降（
Ｐ＜０．０１，表３）。

Ｔａｂ．２　ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＨＩＦ １αａ
ｎｄＡＣＣ１ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｅｓｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎＨＩＦ １αｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝３）ＧｒｏｕｐＨＩＦ １αｐ
ｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（ＨＩＦ １α／β
ａｃｔｉｎ）ＡＣＣ１ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ
（ＡＣＣ１／β ａｃｔｉｎ）Ｎｏｒｍｏｘｉａ
０．６６±０．０３
０．５３±０．０４
５％Ｏ２
１．３７±０．０２
０．８６±０．０２
Ｐ＜０．０１ｖｓｎｏｒｍｏｘｉａｇｒｏｕｐ
Ｔａｂ．３　ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆＡＣＣ１ａｎｄＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡｉｎＡ５４９
ｃｅｌｌｓｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝３）ＧｒｏｕｐＡＣＣ１ｍＲＮＡＳＲＥＢＰ １ｍＲＮＡ
Ｎｏｒｍｏｘｉａ１．００±０．１７
１．００±０．１５
５％Ｏ２
１．５６±０．３０
２．０７±０．３４
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＰＸ ４７８０．５５±０．２０
０．６９±０．１５
５％Ｏ２＋ＰＸ ４７８０．８２±０．０６＃１．１３±０．１３
＃＃
Ｐ＜０．０５，
Ｐ＜０．０１ｖｓｎｏｒｍｏｘｉａｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜
０．０１ｖｓ５％Ｏ２ｇ
ｒｏｕｐ２．３　低氧通过ＨＩＦ １α对ＳＲＥＢＰ １、ＡＣＣ１及ＥＭＴ相关蛋白Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ变化的影响
使用常氧及５％Ｏ２分别处理Ａ５４９细胞；与常氧对照组相比，低氧上调Ａ５４９细胞ＡＣＣ１与ＳＲＥＢＰ １蛋白表达（Ｐ均＜０．０５），Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达下降（Ｐ＜０．０１），Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达上升（Ｐ＜０．０５）；低氧并给予Ａ５４９细胞以ＨＩＦ １α抑制剂ＰＸ ４７８（２５μｍｏｌ）处理，ＡＣＣ１和ＳＲＥＢＰ １蛋白水平均较低氧对照组下降（
Ｐ均＜０．０５）；Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达上升（Ｐ＜０．０１），Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达下降（Ｐ＜０．０５，图２，表４）。

Ｆｉｇ．２　ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｂａｎｄｓｏｆＨＩＦ １α
，ＳＲＥＢＰ １，ＡＣＣ１，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓａｆｔｅｒｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇＨＩＦ １αｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ
１
７中国应用生理学杂志，２０２２，３８（１）
Ｔａｂ．４　ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＨＩＦ １α
，ＳＲＥＢＰ １，ＡＣＣ１，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｅｓｕｎｄｅｒｈｙｐｏｘｉａａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎＨＩＦ １αｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝３）Ｇｒｏｕｐ
ＨＩＦ １α
ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（ＨＩＦ １α／β ａｃｔｉｎ）ＳＲＥＢＰ １ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（ＳＲＥＢＰ １α／β ａｃｔｉｎ）ＡＣＣ１ｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌ（ＡＣＣ１／β ａｃｔｉｎ）Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌ（Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ／β ａｃｔｉｎ）Ｖｉｍｅｎｔｉｎｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌ（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ／β ａｃｔｉｎ）Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＤＭＳＯ
０．２１±０．１１０．８９±０．０９
０．７７±０．０６
０．９４±０．０２
０．７９±０．０３
５％Ｏ２
＋ＤＭＳＯ１．００±０．０６＃＃１．０１±０．０４＃
０．９４±０．０３＃
０．６３±０．０３＃＃
０．９４±０．０４＃
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＰＸ ４７８０．１７±０．０８０．８４±０．０５
０．５４±０．１２
０．７８±０．０５
０．７９±０．０２
５％Ｏ２
＋ＰＸ ４７８０．７２±０．０２ ０．９４±０．０４
０．６４±０．０２
０．７６±０．０３
０．６８±０．０３
＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓＮｏｒｍｏｘｉａ＋ＤＭＳＯｇｒｏｕｐ； Ｐ＜０．０５，
Ｐ＜０．０１ｖｓ５％Ｏ２
＋ＤＭＳＯｇｒｏｕｐ２．４　低氧通过ＳＲＥＢＰ １对Ａ５４９细胞的迁移及ＡＣＣ１表达的影响
转染ｓｉ ＲＮＡ获得敲低ＳＲＥＢＰ １的Ａ５４９细胞；与常氧组相比，Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验显示ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组细胞迁移数较对照组减少（２２３±１１ｖｓ１３７±６，Ｐ＜０．０１）；给予ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组低氧处理，与低氧对照组相比ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组细胞迁移数减少（３５１±１１ｖｓ１５３±９，Ｐ＜０．０１），与常氧对照组相比差异无统计学意义（１５３±９ｖｓ１３７±６，Ｐ＞０．０５）；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到ｓｉ ＳＲＥＢＰ １组较常氧组相比，ＡＣＣ１与Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达下降，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达上升（Ｐ均＜０．０１）；低氧处理ｓｉ ＳＲＥＢＦ １组后，与低氧对照组相比，ＡＣＣ１蛋白表达下降，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达上升（Ｐ均＜０．０１），Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达下降（Ｐ＜０．０５，
图３，表５）。

Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｉ ＲＮＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｋｎｏｃｋｄｏｗｎ
ＳＲＥＢＰ １ｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｕｎｄｅｒｎｏｒｍｏｘｉａａｎｄ５％Ｏ２ｃ
ｏｎｄｉｔｉｏｎｓＡ：Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｓｉ ＲＮＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｋｎｏｃｋｄｏｗｎＳＲＥＢＰ １ｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ（Ｓｃａｌｅ＝２００μｍ）；Ｂ：ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｂａｎｄｓｏｆＨＩＦ １α，ＳＲＥＢＰ １，ＡＣＣ１，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ
Ｔａｂ．５　ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＨＩＦ １α
，ＳＲＥＢＰ １，ＡＣＣ１，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｅｓｕｎｄｅｒｎｏｒｍｏｘｉａａｎｄ５％Ｏ２ｃ
ｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｆｔｅｒｓｉ ＲＮＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｔｏｋｎｏｃｋｄｏｗｎＳＲＥＢＰ １（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）ＧｒｏｕｐＨＩＦ １α
ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（ＨＩＦ １α／β ａｃｔｉｎ）ＳＲＥＢＰ １ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ（ＳＲＥＢＰ １α
／β
ａｃｔｉｎ）ＡＣＣ１ｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌ（ＡＣＣ１／
β ａｃｔｉｎ）Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌ（Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ／
β ａｃｔｉｎ）Ｖｉｍｅｎｔｉｎｐｒｏｔｅｉｎ
ｌｅｖｅｌ（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ／
β ａｃｔｉｎ）Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ｓｉ ＮＣ０．５２±０．０４０．９６±０．０２１．０５±０．０９
１．１２±０．０６
０．５１±０．０５
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ｓｉ ＳＲＥＢＰ １０．５４±０．１１０．８８±０．０５
０．６３±０．１２
１．５８±０．０９
０．４８±０．０７
５％Ｏ２＋ｓ
ｉ ＮＣ０．９７±０．０８ ０．９９±０．０３ １．０９±０．０３
０．７５±０．０２
０．５３±０．０２
５％Ｏ２
＋ｓｉ ＳＲＥＢＰ １０．９３±０．０３０．８３±０．０４０．５０±０．０３
＃＃
０．８２±０．０１
＃＃
０．５０±０．０４
＃
Ｐ＜０．０５，
Ｐ＜０．０１ｖｓＮｏｒｍｏｘｉａ＋ｓｉ ＮＣｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ５％Ｏ２
＋ｓｉ ＮＣｇｒｏｕｐ２．５　低氧通过ＡＣＣ１调控ＬＡ对Ａ５４９细胞迁移的影响
转染慢病毒获得敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞；敲低ＡＣＣ１后Ａ５４９细胞在常氧和５％Ｏ２条件下迁移细胞数差异无统计学意义（９９±１０．６ｖｓ８０±６．４３，Ｐ＞０．０５）；５％Ｏ２条件下Ｖｉｍｅｎｔｉｎ与Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达较常氧组差异无统计学意义（Ｐ＞０．０５）；低氧处理敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞并给予ＬＡ（２５μｍｏｌ），Ａ５４９细胞的迁移数较低氧组上升（１３４±１４ｖｓ７９±６，Ｐ＜０．０５）且Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达较低氧组增加（Ｐ均＜０．０５），Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ蛋白表达较低氧组下降（Ｐ＜０．０１
，图４，图５，表６）。

Ｆｉｇ．４　ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＬＡｏｎｔｈｅｍｉｇｒａｔｉｏｎｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓｔｈａｔ
ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＡＣＣ１ｕｎｄｅｒｎｏｒｍｏｘｉａａｎｄｈｙｐｏｘｉｃｃｏｎｄｉ ｔｉｏｎｓ（Ｓｃａｌｅ＝２００μｍ）
２７ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０２２，３８（１）
Ｆｉｇ．５　ＲｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅｂａｎｄｓｏｆＡＣＣ１，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎ ｔｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓｔｈａｔｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＡＣＣ１ａｎｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔＬＡｕｎｄｅｒｎｏｒｍｏｘｉａａｎｄｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ｔａｂ．６　ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆＡＣＣ１，Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍ ｅｎｔｉｎｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｅｓｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ
ｔｈａｔｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆＡＣＣ１ａｎｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔＬＡｕｎｄｅｒ
ｎｏｒｍｏｘｉａａｎｄｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（珋ｘ±ｓ，ｎ＝３）
Ｇｒｏｕｐ
Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ
（Ｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ／
β ａｃｔｉｎ）
Ｖｉｍｅｎｔｉｎ
ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌ
（Ｖｉｍｅｎｔｉｎ
／β ａｃｔｉｎ）
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＤＭＳＯ＋ｓｈ ＮＣ０．６４±０．０６０．８０±０．０３
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＤＭＳＯ＋ｓｈ ＡＣＣ１０．８９±０．１２ ０．５０±０．０３
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＬＡ＋ｓｈ ＮＣ０．６３±０．０９０．７７±０．０４
Ｎｏｒｍｏｘｉａ＋ＬＡ＋ｓｈ ＡＣＣ１０．３３±０．０７０．８１±０．０１５％Ｏ
２
＋ＤＭＳＯ＋ｓｈ ＮＣ０．５４±０．０２ １．０８±０．０５
５％Ｏ
２
＋ＤＭＳＯ＋ｓｈ ＡＣＣ１０．７２±０．０７０．６１±０．０２
５％Ｏ
２
＋ＬＡ＋ｓｈ ＮＣ０．６２±０．０４０．８８±０．０９
５％Ｏ
２
＋ＬＡ＋ｓｈ ＡＣＣ１０．４９±０．０１＃＃０．７９±０．０１＃
Ｐ＜０．０１ｖｓＮｏｒｍｏｘｉａ＋ＤＭＳＯ＋ｓｈ ＮＣｇｒｏｕｐ；＃Ｐ＜
０．０５，＃＃Ｐ＜０．０１ｖｓ５％Ｏ
２
＋ＤＭＳＯ＋ｓｈ ＡＣＣ１ｇｒｏｕｐ
３　讨论
实体肿瘤由于氧扩散障碍、肿瘤微血管系统异常等因素，导致肿瘤细胞处于一种难以纠正的低氧环境，称为肿瘤低氧微环境［９］。

肿瘤低氧微环境影响包括血管生成、能量代谢、肿瘤迁移在内的多种生物学行为［１０］。

研究发现，肿瘤细胞在低氧微环境中的代谢重编程，其与脂质代谢的改变及肿瘤细胞的迁移有密切联系，但其机制尚不清晰［１１，１２］。

本课题组在前期的研究中，通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ实验检测到低氧可促进Ａ５４９细胞迁移，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到低氧处理Ａ５４９细胞后ＡＣＣ１蛋白表达上升，同时使Ｅ Ｃａｄ ｈｅｒｉｎ蛋白表达下降，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ蛋白表达上升，该结果证实低氧通过上调ＡＣＣ１促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移及ＥＭＴ转化［８］，但具体机制不明。

ＨＩＦ １α是肿瘤低氧微环境中调控肿瘤进展的重要转录因子，其在低氧条件下结合ＨＩＦ １β形成转录复合体，结合许多基因启动子的ＨＲＥ序列，调节包括能量代谢与浸润转移在内的多种肿瘤生物学行为。

研究报道，ＨＩＦ １α在低氧条件下可以增加丙酮酸激酶 ２、磷酸激酶 １、葡萄糖转运蛋白 １（ｇｌｕｃｏｓｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ１，ＧＬＵＴ１）和乳酸脱氢酶Ａ（ｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙ ｄｒｏｇｅｎａｓｅＡ，ＬＤＨＡ）基因的表达，促进肿瘤细胞糖类的代谢，促进细胞的生长与转移［１３，１４］。

本课题组前期研究发现低氧处理Ａ５４９细胞促进其迁移，同时ＲＴ ｑＰＣＲ检测到ＡＣＣ１ｍＲＮＡ的上升，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到ＡＣＣ１蛋白水平表达的增加，而ＨＩＦ １α在低氧条件下降解减少引起其含量相对增多。

由此推测，ＡＣＣ１在低氧条件下转录水平的上调可能与ＨＩＦ １α有密切联系。

为验证该假设，本实验使用ＨＩＦ １α抑制剂处理Ａ５４９细胞并给予低氧处理，结果显示使用ＨＩＦ １α抑制剂后低氧对Ａ５４９细胞的促迁作用减弱，同时ＲＴ ｑＰＣＲ检测到ＡＣＣ１ｍＲＮＡ水平较低氧组明显下降，但与常氧组相比差异无统计学意义。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测到ＡＣＣ１蛋白表达与低氧组相比下降但与常氧组相比差异无统计学意义。

此外，ＥＭＴ相关蛋白较低氧对照组相比，Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ表达上升，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ表达下降，即低氧促进ＥＭＴ的表型被逆转，结果显示低氧通过ＨＩＦ １α上调ＡＣＣ１促进Ａ５４９细胞迁移。

ＳＲＥＢＰ １是细胞内维持脂类代谢稳定的重要因子［１５］，通过调节与脂肪酸从头合成途径有关基因调节脂类在肿瘤细胞内的代谢［１６，１７］，其中包括ＡＣＣ１。

研究报道，ＨＩＦ １α在低氧条件下进入细胞核促进ＳＲＥＢＦ １转录［１８］。

然而关于低氧条件下Ａ５４９细胞中ＳＲＥＢＰ １水平变化及其对ＡＣＣ１的影响尚不明确。

因此本研究检测低氧处理Ａ５４９细胞后ＳＲＥＢＰ １蛋白及ｍＲＮＡ的变化，发现低氧上调ＳＲＥＢＰ １蛋白及ｍＲＮＡ水平，并且使用ＨＩＦ １α抑制剂后这种促进作用消失。

随后，本研究通过转染ｓｉ ＲＮＡ获得敲低ＳＲＥＢＰ １的Ａ５４９细胞，低氧对于该细胞的促迁作用减弱且ＡＣＣ１表达较对照组明显降低。

因此上述结果提示ＳＲＥＢＰ １在低氧条件下通过ＨＩＦ １α上调ＡＣＣ１促进Ａ５４９细胞迁移的过程中发挥作用。

敲低ＳＲＥＢＰ １能够减弱低氧对于Ａ５４９细胞的促迁作用，该作用可能与下调ＡＣＣ１进而影响脂肪酸合成有关。

ＡＣＣ１是脂肪酸代谢的限速酶［１９］，文献报道敲除ＡＣＣ１会抑制肺腺癌细胞的增殖，并且这种作用是以脂肪酸合成为基础［２０］。

以高脂饮食饲养的小鼠其肺部肿瘤结节明显高于正常饮食组，说明高脂肪饮食有助于癌症细胞的转移［２１］，提示脂类代谢与肿瘤的发生与转移有密切关系。

有研究报道，敲低
３
７
中国应用生理学杂志，２０２２，３８（１）
脂肪酸代谢的另一种关键酶 脂肪酸合成酶（ｆａｔｔｙａｃｉｄｓｙｎｔｈａｓｅ，ＦＡＳＮ）可以抑制膀胱癌细胞的ＵＭＵＣ３的迁移能力［２２］。

该结果表明，干预肿瘤细胞的脂肪酸代谢可能影响肿瘤细胞的迁移，然而关于低氧、ＡＣＣ１和肺腺癌细胞迁移之间的联系则鲜见报道。

为进一步探索低氧条件下ＡＣＣ１与肺腺癌细胞迁移的联系，本课题组在前期研究中给予敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞以脂肪酸处理，检测Ａ５４９细胞迁移能力的变化，结果显示补充脂肪酸可部分恢复低氧对于敲低ＡＣＣ１的Ａ５４９细胞的促迁作用［８］；随后进一步检测该条件下Ａ５４９细胞处理后ＥＭＴ相关蛋白的变化，发现ＥＭＴ相关蛋白Ｅ Ｃａｄｈｅｒｉｎ表达下降，Ｖｉｍｅｎｔｉｎ表达上升，即与低氧促进Ａ５４９细胞迁移相关的ＥＭＴ表型得到恢复。

因此推测低氧通过ＨＩＦ １α／ＳＲＥＢＰ １／ＡＣＣ１途径促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移可能与脂肪酸合成有关。

关于脂肪酸与肿瘤细胞迁移之间的联系，目前认为主要有两个关键点：１）能量合成，２）脂筏合成。

肿瘤细胞通过重编程脂代谢途径获取迁移所需能量，同时利用脂肪酸合成迁移所需结构（如脂筏等）［２３］。

通过干涉ＨＩＦ １α／ＳＲＥＢＰ １／ＡＣＣ１途径可能对肺腺癌的进展具有抑制作用。

此外，亦有研究报道低氧能够促进乳腺癌细胞ＭＣＦ ７及胶质瘤细胞Ｕ８７等多种肿瘤细胞迁移且其机制与ＥＭＴ有密切联系［２４，２５］，这提示本研究结果可能存在于其他非肺腺癌细胞系中，但具体机制仍有待深入研究。

综上所述，本研究结果显示，低氧能够通过ＨＩＦ １α／ＳＲＥＢＰ １途径上调肺腺癌Ａ５４９细胞的ＡＣＣ１表达进而促进肺腺癌Ａ５４９细胞迁移，并且这种促进作用与脂肪酸的合成相关。

本研究证明低氧通过ＨＩＦ １α／ＳＲＥＢＰ １／ＡＣＣ１途径参与肺腺癌细胞的迁移，确定ＡＣＣ１在肺腺癌细胞迁移中的作用，有助于加深对肺腺癌细胞迁移的分子机制的了解，为肺腺癌的新型靶向治疗提供理论依据，通路所涉及的分子可能成为肺腺癌治疗新的靶点。

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黄芪注射液对缺血性心肌病大鼠心肌的保护作用
李少情１＋，张青山３＋，赵　婷２，白婷婷３，宣丽颖４，王　羽４△，赵　明３
△
（１．沧州市中心医院，沧州０６１０００；２．吉林大学基础医学院，长春１３００００；３．内蒙古民族大学附属医院，通辽０２８０００；
４．内蒙古蒙药心脑血管药理学重点实验室，通辽０２８０００）
【摘要】　目的：探究黄芪注射液对缺血性心肌病大鼠心肌保护作用及其机制。

方法：将３６只雄性鼠随机分成：对照组（１２只）、缺血性心肌病组（
１２只）及黄芪注射液组（１２只）；缺血性心肌病组和黄芪注射液组的大鼠开胸结扎冠状动脉，建立缺血心肌病大鼠模型；建立心肌缺血模型后，黄芪注射液组术后注射黄芪注射液（每周一次，剂量：１０ｇ／ｋｇ体重），共注射４次，其他两组腹腔均注射相同剂量的生理盐水；
４周后给予３组大鼠麻醉后行心电图及心脏彩超后，处死大鼠取心肌标本行电镜检查，观察其心肌病理超微结构的变化，检测大鼠心肌细胞线粒体Ｃ
ａ２
＋浓度和心肌细胞线粒体融合蛋白ｍｉｔｏｆｕｓｉｎ１（Ｍｆｎ１）及凋亡因子Ｃ／ＥＢＰ同源蛋白（ｃｈｏｐ）表达，以及黄芪注射液对大鼠心肌细胞ＡＴＰ敏感钾通道电流的作用。

结果：与对照组比较，缺血性心肌病组中大鼠出现心
律失常现象；心室扩大，ＥＦ值降低；心肌排列紊乱，线粒体空泡化严重；线粒体Ｃａ２
＋浓度增加（Ｐ＜０．０１）；Ｍｆｎ１表达减低（Ｐ＜０．０５），
ｃｈｏｐ表达增加（Ｐ＜０．０１）；与缺血性心肌病组比较，黄芪注射液组中大鼠心律失常发生率明显减少，心肌细胞动作电位时程缩短，
心脏彩超及心肌病理明显改善并存在大量线粒体融合，心肌线粒体Ｃ
ａ２
＋浓度和ｃｈｏｐ表达明显减少（Ｐ＜０．０１），而Ｍｆｎ１表达明显增加（Ｐ＜０．０１），心肌细胞ＡＴＰ敏感钾电流明显增加（Ｐ＜０．０１），该作用可被ＡＴＰ敏感钾通道特异性阻断剂格列本脲阻断。

结论：黄芪注射液明显减少缺血性心肌病大鼠心律失常的发生率，继而改善缺血性心肌病大鼠心脏功能、减轻心肌病理损伤，其作用机制可能通过心肌细胞ＡＴＰ敏感钾通道所介导。

【关键词】　黄芪注射液；缺血性心肌病；心律失常；动作电位；ＡＴＰ敏感钾通道；大鼠
【
ＫＥＹＷＯＲＤＳ】　ａｓｔｒａｇａｌｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ；　ｉｓｃｈｅｍｉｃｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ；　ａｒｒｈｙｔｈｍｉａ；　ａｃｔｉｏｎｐｏｔｅｎｔｉａｌ；　ＡＴＰ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ；　ｒａｔ
【中图分类号】Ｒ３３１．３，Ｒ３３２ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０２２）０１ ０７５ ００４【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．６２１７．２０２２．０１４
【基金项目】国家自然科学基金项目（８１３６０５８７；８１９６０７３５）；
内蒙古自然科学基金（２０２１ＭＳ０８０６９）；内蒙古自治区高等学校“青年科技英才支持计划”（ＮＪＹＴ １９ Ｂ１４）【收稿日期】２０２１ ０５ １４【修回日期】２０２１ １２ ２７　△【通讯作者】Ｔｅｌ：１３４７４８５９９９１，１５７５０５１８５６０；Ｅ－ｍａｉｌ：ｌａｎｇ
ｚｈｅ７３＠１６３．ｃｏｍ，ｓｈｅｎ３４８＠１２６．ｃｏｍ．＋
：为共同第一作者
随着社会经济的快速发展，快节奏的生活常伴随着不良的饮食、作息习惯，这些不良的习惯带来了诸多健康问题，其中包括近年来发病率逐年攀升的心血管疾病，２０１５年发布的中国心血管病报告称，心血管病占居民疾病死亡构成的４０％以上，为我国居民的首位死因。

缺血性心肌病的发生，也是
临床上较为常见的心血管疾病，也是慢性冠脉疾病的一种，
心室扩大及心力衰竭都是临床上常见的表现［
１］。

其原因是由于长期冠脉缺血导致心肌细胞死亡及纤维组织增生等病理改变引发的心肌重塑。

研究表明线粒体在缺血性心肌病心肌重塑中起着独特和关键的作用。

异常增高的胞浆中游
离Ｃａ２＋浓度（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａ２＋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，［Ｃａ２
＋］ｉ）出现异
常增高现象时，可易于诱发线粒体发生功能障碍进而加重心
脏的病理损伤［２］。

正常心肌中ＡＴＰ敏感性钾通道（ＡＴＰ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｃｈａｎｎｅｌ，ＫＡＴＰ）由于细胞中高浓度ＡＴＰ而处于关闭状态，当心肌出现缺血情况下，ＫＡＴＰ开放，
缩短动作电位时程，Ｋ＋外流，加速复极，动作电位平台期缩短，进而减
５
７中国应用生理学杂志，２０２２，３８（１）。