9种抗菌药物对大肠埃希菌最小抑菌浓度的测定
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关键词：抗菌药物；大肠埃希菌；药敏试验；最小抑菌浓度
中图分类号：S859.7
文献标识码：A
文章编号:1007-5038（2020）03-0052-05
抗菌药物在保证畜禽健康、减少病原感染、保证 动物性食品安全中起着重要作用。畜禽养殖过程中 的抗菌药物使用非常广泛，用量也非常巨大，2013 年统计，美国80%的抗生素用于动物养殖和诊疗 ， 只有20%用于人类自身疾病用药⑴。这种情况在 世界各国都比较普遍，我国在抗菌药物上的使用就 更为普遍，尽管国家对抗菌药物的使用进行了严格 的规定，但是药物的使用量和应用率还是比较 高"切，特别是不对症、对因、限量使用抗菌药物，造 成了药物的超量使用，甚至滥用，由此带来了严重的 环境、健康和食品安全问题，细菌耐药性问题也日益 突出⑷。药物的使用不当和滥用等原因会导致动物 源性食品中的药物残留，危害人的健康⑸。大量抗 菌药物用于动物疾病的预防和治疗，对细菌的耐药 性产生巨大的选择压力，养殖环节已经成为耐药菌 产生的主要发生地。将抗菌药物的用量控制在安全 有效的剂量范围内十分重要，在选择抗菌药物时需 要对药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）进行测定。常用的MIC测定方 法主要有试管倍比稀释法⑷、纸片法⑺、牛津杯 法⑷、打孔法⑸以及微量肉汤稀释法等。其中试 管倍比稀释法操作相对麻烦、费力耗材；纸片法和牛 津杯法也存在测量抑菌圈时容易出现偏差的问题； 微量肉汤法简埃希菌最小抑菌浓度的测定
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号1209A023,纯度N 98%）、硫酸链霉素（批号 615C021,纯度＞720 IU/mg）、硫酸新霉素（批号 IN0130,纯度$98%）、头抱嗟咲钠（批号6O8BO21, 纯度$98%）、氟苯尼考（批号1121B021，纯度$ 98%）、替米考星（批号115B021,纯度$90%）,北京 索莱宝科技有限公司产品 。 1.1.2 菌株 大肠埃希菌标准株（Escherichia coli ） （ATCC 25922），由西北农林科技大学动物医学院兽 医公共卫生与食品安全实验室保存、提供。 1.1.3 主要试剂与仪器 麦氏比浊管、96孔板、酶 标仪（Multiskan FC）,赛默飞世尔仪器有限公司；恒 温震荡培养箱，电子分析天平；MH肉汤培养基，LB 肉汤培养基和PBS缓冲液，麦康凯培养基均由西北 农林科技大学动物医学院兽医公共卫生与食品安全 实验室提供。 1.2方法 1.2.1抗菌药物原液的配制 以稀释梯度的第1孔 浓度的1 000倍计算药物的用量，称量所需要的药 物，根据其溶解性（氟苯尼考极易溶于二甲基甲酰胺 等）选用适宜的溶剂（表1）,各药物用500 “L溶剂完 全稀释，并用PH7的PBS缓冲液稀释到1 280 Mg/ mL作为保存浓度（青霉素为20 000 Mg/mU0配制 好的药液装到1.5 ml离心管中，用封口膜封口贮存 于一20°C冰箱中，保存时间不超过30 d,使用时用 PH7的PBS缓冲液进行稀释，使药物达到所需的浓 度（使用的浓度梯度参照临床合成药物成品的使用 剂量）。二甲基甲酰胺和甲醇过滤除菌，其余各溶剂
人用抗菌药物应用到畜禽养殖和动物疾病防治中， 产生细菌耐药性，给人类疾病防治带来问题，我国制 定了兽用药物名录，其中包括抗菌药物使用名录和 要求。但在选用药敏纸片进行细菌敏感性检测的时 候，市场上缺少可选择专门的兽用抗菌药物纸片，或 者药物的种类少，不能满足兽医临床细菌药敏检测 的需求。
针对这个问题，本课题组拟进行兽用抗菌药物 纸片的研制，前期需要对药物进行筛选和针对目标 菌的MIC测定。本研究选取了兽医临床上使用较 多的9种兽用抗菌药物（头抱廛咲钠、硫酸链霉素、 强力霉素、土霉素等），通过微量肉汤稀释法测定了 这些药物对大肠埃希菌标准株的MIC,为药敏纸片 研制中药物浓度的确定提供了直接依据，也为这些 药物的临床应用提供了参考。
收稿日期=2019-05-06
基金项目：2017年西北农林科技大学大学生创新训练计划项目（校级）（1201710712020）,2018年西北农林科技大学大学 生创新训练计划项目（国家级）（201810712015）
作者简介：苏梦茹（1998-）,女.山东济宁人，本科，动物医学专业。△同等贡献作者。*通讯作者
动物医学进展.2020,41(3):52-56 Progress in Veterinary Medicine
9种抗菌药物对大肠埃希菌最小抑菌浓度的测定
苏梦茹△，马培培△，李鑫鑫，刘 沉，李妍，姚倩，郭抗抗* （西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）
摘要：畜禽养殖中会用到一些抗菌药物，而药物选用需要进行药物敏感性试验，目前市售的药敏纸片 多为人用抗菌药物，为了制备兽用抗菌药物的药敏纸片，需要对药物的最小抑菌浓度（MIC）进行测定。该研 究筛选了国家兽用药物名录中规定的、兽医临床上常用6类共9种抗菌药物（头范囉咲钠、硫酸链霉素、强力 霉素、土霉素、氨节西林、氟苯尼考、替米考星、硫酸新霉素、青霉素），以大肠埃希菌为指标菌，通过微量肉汤 稀释法分别测定了 9种常用抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）。结果表明，头抱瘗咲钠、硫酸链霉素、强力霉 素、土霉素、氨节西林、氟苯尼考、替米考星、硫酸新霉素、青霉素对指标菌的MIC值分别为为2、4、4、16、8、 16、64、32、250 pg/mL。研究结果为这些药物的临床应用和药敏纸片的研制提供了基础资料。
1材料与方法
1.1材料 1.1.1药物 按照原农业部2014年《乡村兽医基本 用药名录》中规定，结合兽医临床抗菌药物使用情况 调查，选择9种常用兽用抗菌药物。青霉素（批号 B25911 ,纯度$97%）,上海源叶生物科技有限公司 产品；氨节西林（批号130410 - 201207,纯度二 86.5%）、土霉素（批号 130305 - 201321,纯度 Z 98%）,中国食品药品检定研究院产品；强力霉素（批
取各溶剂500l用ph7的pbs缓冲液稀释1000倍后待用试验组在96孔板中的其中一行的前5个孔中的分别加入稀释好的溶剂100jzl和lb培养液100l在第6孔和第7孔后做阴性和阳性对照孔加入lb培养基和ph7的pbs各100l大肠埃希菌标准株菌液用lb培养基稀释到05个麦氏比浊度分别在试验组各孔和阳性对照孔加入50l菌液阴性对照空加入50l培养基进行3次平行试验37c恒温培养16h取出在酶标仪上测定各孔od600nm值计算各孔抑菌率当抑菌率大于5时认定孔中所含的溶剂的量对细菌的生长有影响
中图分类号：S859.7
文献标识码：A
文章编号:1007-5038（2020）03-0052-05
抗菌药物在保证畜禽健康、减少病原感染、保证 动物性食品安全中起着重要作用。畜禽养殖过程中 的抗菌药物使用非常广泛，用量也非常巨大，2013 年统计，美国80%的抗生素用于动物养殖和诊疗 ， 只有20%用于人类自身疾病用药⑴。这种情况在 世界各国都比较普遍，我国在抗菌药物上的使用就 更为普遍，尽管国家对抗菌药物的使用进行了严格 的规定，但是药物的使用量和应用率还是比较 高"切，特别是不对症、对因、限量使用抗菌药物，造 成了药物的超量使用，甚至滥用，由此带来了严重的 环境、健康和食品安全问题，细菌耐药性问题也日益 突出⑷。药物的使用不当和滥用等原因会导致动物 源性食品中的药物残留，危害人的健康⑸。大量抗 菌药物用于动物疾病的预防和治疗，对细菌的耐药 性产生巨大的选择压力，养殖环节已经成为耐药菌 产生的主要发生地。将抗菌药物的用量控制在安全 有效的剂量范围内十分重要，在选择抗菌药物时需 要对药物的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）进行测定。常用的MIC测定方 法主要有试管倍比稀释法⑷、纸片法⑺、牛津杯 法⑷、打孔法⑸以及微量肉汤稀释法等。其中试 管倍比稀释法操作相对麻烦、费力耗材；纸片法和牛 津杯法也存在测量抑菌圈时容易出现偏差的问题； 微量肉汤法简埃希菌最小抑菌浓度的测定
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号1209A023,纯度N 98%）、硫酸链霉素（批号 615C021,纯度＞720 IU/mg）、硫酸新霉素（批号 IN0130,纯度$98%）、头抱嗟咲钠（批号6O8BO21, 纯度$98%）、氟苯尼考（批号1121B021，纯度$ 98%）、替米考星（批号115B021,纯度$90%）,北京 索莱宝科技有限公司产品 。 1.1.2 菌株 大肠埃希菌标准株（Escherichia coli ） （ATCC 25922），由西北农林科技大学动物医学院兽 医公共卫生与食品安全实验室保存、提供。 1.1.3 主要试剂与仪器 麦氏比浊管、96孔板、酶 标仪（Multiskan FC）,赛默飞世尔仪器有限公司；恒 温震荡培养箱，电子分析天平；MH肉汤培养基，LB 肉汤培养基和PBS缓冲液，麦康凯培养基均由西北 农林科技大学动物医学院兽医公共卫生与食品安全 实验室提供。 1.2方法 1.2.1抗菌药物原液的配制 以稀释梯度的第1孔 浓度的1 000倍计算药物的用量，称量所需要的药 物，根据其溶解性（氟苯尼考极易溶于二甲基甲酰胺 等）选用适宜的溶剂（表1）,各药物用500 “L溶剂完 全稀释，并用PH7的PBS缓冲液稀释到1 280 Mg/ mL作为保存浓度（青霉素为20 000 Mg/mU0配制 好的药液装到1.5 ml离心管中，用封口膜封口贮存 于一20°C冰箱中，保存时间不超过30 d,使用时用 PH7的PBS缓冲液进行稀释，使药物达到所需的浓 度（使用的浓度梯度参照临床合成药物成品的使用 剂量）。二甲基甲酰胺和甲醇过滤除菌，其余各溶剂
人用抗菌药物应用到畜禽养殖和动物疾病防治中， 产生细菌耐药性，给人类疾病防治带来问题，我国制 定了兽用药物名录，其中包括抗菌药物使用名录和 要求。但在选用药敏纸片进行细菌敏感性检测的时 候，市场上缺少可选择专门的兽用抗菌药物纸片，或 者药物的种类少，不能满足兽医临床细菌药敏检测 的需求。
针对这个问题，本课题组拟进行兽用抗菌药物 纸片的研制，前期需要对药物进行筛选和针对目标 菌的MIC测定。本研究选取了兽医临床上使用较 多的9种兽用抗菌药物（头抱廛咲钠、硫酸链霉素、 强力霉素、土霉素等），通过微量肉汤稀释法测定了 这些药物对大肠埃希菌标准株的MIC,为药敏纸片 研制中药物浓度的确定提供了直接依据，也为这些 药物的临床应用提供了参考。
收稿日期=2019-05-06
基金项目：2017年西北农林科技大学大学生创新训练计划项目（校级）（1201710712020）,2018年西北农林科技大学大学 生创新训练计划项目（国家级）（201810712015）
作者简介：苏梦茹（1998-）,女.山东济宁人，本科，动物医学专业。△同等贡献作者。*通讯作者
动物医学进展.2020,41(3):52-56 Progress in Veterinary Medicine
9种抗菌药物对大肠埃希菌最小抑菌浓度的测定
苏梦茹△，马培培△，李鑫鑫，刘 沉，李妍，姚倩，郭抗抗* （西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100）
摘要：畜禽养殖中会用到一些抗菌药物，而药物选用需要进行药物敏感性试验，目前市售的药敏纸片 多为人用抗菌药物，为了制备兽用抗菌药物的药敏纸片，需要对药物的最小抑菌浓度（MIC）进行测定。该研 究筛选了国家兽用药物名录中规定的、兽医临床上常用6类共9种抗菌药物（头范囉咲钠、硫酸链霉素、强力 霉素、土霉素、氨节西林、氟苯尼考、替米考星、硫酸新霉素、青霉素），以大肠埃希菌为指标菌，通过微量肉汤 稀释法分别测定了 9种常用抗菌药物的最小抑菌浓度（MIC）。结果表明，头抱瘗咲钠、硫酸链霉素、强力霉 素、土霉素、氨节西林、氟苯尼考、替米考星、硫酸新霉素、青霉素对指标菌的MIC值分别为为2、4、4、16、8、 16、64、32、250 pg/mL。研究结果为这些药物的临床应用和药敏纸片的研制提供了基础资料。
1材料与方法
1.1材料 1.1.1药物 按照原农业部2014年《乡村兽医基本 用药名录》中规定，结合兽医临床抗菌药物使用情况 调查，选择9种常用兽用抗菌药物。青霉素（批号 B25911 ,纯度$97%）,上海源叶生物科技有限公司 产品；氨节西林（批号130410 - 201207,纯度二 86.5%）、土霉素（批号 130305 - 201321,纯度 Z 98%）,中国食品药品检定研究院产品；强力霉素（批
取各溶剂500l用ph7的pbs缓冲液稀释1000倍后待用试验组在96孔板中的其中一行的前5个孔中的分别加入稀释好的溶剂100jzl和lb培养液100l在第6孔和第7孔后做阴性和阳性对照孔加入lb培养基和ph7的pbs各100l大肠埃希菌标准株菌液用lb培养基稀释到05个麦氏比浊度分别在试验组各孔和阳性对照孔加入50l菌液阴性对照空加入50l培养基进行3次平行试验37c恒温培养16h取出在酶标仪上测定各孔od600nm值计算各孔抑菌率当抑菌率大于5时认定孔中所含的溶剂的量对细菌的生长有影响