免疫组化方法
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单核细胞，粒细胞表面。 CD20： B细胞标记物。 CD45RO、CD3：T细胞标记物。 CD57：为自然杀伤细胞的标记物。 CD38：为浆细胞的标记物。 CD68：主要标记各种组织中的巨噬细胞。
（五）、神经内分泌标记物： 嗜铬素A（Chromogranin, CgA）：
存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。 突触素（Synaptophysin, Sy）：
生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
（二）显示物：
主要有： 1、酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphoeroaidase, HRP)
AP与不同的底物作用，可形成不同颜色的终产物。 与萘酚（As-Mx）和快蓝（Fast blue）作用； 与快红（Fast red）作用。 缺点：形成的沉淀溶于有机溶剂。
三、主要方法： （一）、直接法： （二）、间接法：特点：是经过了第二抗体放大
效应 （三）、PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体
形成复合物，通过第二抗体的桥接与第 一抗体结合，然后以酶底物反应检出。
（四）、ABC法：
生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具 有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4 个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与 抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结 合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的 生物素的结合反应，而以适当方式显示。
2）、对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 ER
乳腺癌 c-erbB-2
六、免疫组化在病理诊断及鉴别诊断 和研究中的 应用
（一）、中间丝免疫组化的意义： 中间丝有五种：
分布部位 1、角蛋白 上皮组织（表皮，间皮
（Keratin） 消化道粘膜上皮，腺上皮，
存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞， 神经内分泌细胞中。
髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein, MBP）：
（六）、激素及激素受体类标记： 雄激素受体（Androgen receptor, AR）： 雌激素受体（Estrogen receptor, ER） 孕激素受体（Progesterone receptor, PR）： 垂体激素：
（五）、S-P法（LSAB）：
采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
（六）、EnvisionⅠ法（二步法）：
原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可 结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感 性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡 聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是 多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方 法更省时，简便。
keratinvimentin上皮性肿瘤keratin滑膜肿瘤vimentin间皮肿瘤上皮样肉瘤癌肉瘤desoractin肌源性肿瘤cd34or血管性肿瘤keratins100ormbp神经鞘膜瘤vimentinlca淋巴细胞aact骨肿瘤纤维组织细胞肿gfap胶质细胞肿瘤keratinnseorsyvimentinnf节细胞神经母细胞瘤这里必须强调免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则
内脏非角化上皮）
意义 癌
2 、波形蛋白 间叶组织（成纤维细胞，软
非肌源
（Vimentin） 骨细胞，巨噬细胞，内皮细胞， 性肉瘤
黑色素细胞等。
3、结蛋白
肌组织
肌源性肿瘤
（Desmin）
4、神经胶质纤 星型细胞，室管膜细胞 胶质瘤
维酸性蛋白
（GFAP）
5 、 神经丝 大部分中枢及外周神经元 交感，副交感
3）、合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
4、减少or 消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
5、对照： 阳性对照： 阴性对照：
6、免疫组化结果的判断： 特异性染色与非特异性染色鉴别点：
①特异性反应产物常分布于特定的部位， 具有结构性。 ②在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结
ACTH, GH, PRL, LH, TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。 降钙素（Calcitotin, CT）： 甲状腺旁细胞（C细胞）分泌。
以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断
其联合应用的作用和意义：
Keratin＋
Vimentin－
上皮性肿瘤
Keratin＋ Vimentin＋
免疫组织化学理论及技术
一、 免疫组织化学的基本概念：
组织化学：
免疫组织化学：是组织化学的一个分支即组 成部分，它以免疫学的抗原抗体反应基本原理为 其特点，同时还具备组织化学的一般特征。是指 应用免疫学原理，通过特异的抗原抗体反应，附 一可见的标志物，在组织原位显示抗原成分的方 法。
肿瘤及各种疾病的病理学研究概括起来主要 在基因和蛋白水平上进行的研究。
四、以LSAB法为例简单介绍染色步骤：
①石蜡切片脱蜡－水；
②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min；
③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵 育5min；
④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过 夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，370C， 30min；
滑膜肿瘤 间皮肿瘤 上皮样肉瘤 癌肉瘤
Keratin－ Vimentin＋ 瘤
Keratin－ Vimentin－
Des＋or Actin＋ 肌源性肿瘤
CD34＋or FⅧ＋ 血管性肿瘤
S-100＋or MBP ＋ 神经鞘膜瘤
LCA＋
淋巴细胞
AACT＋ 骨肿瘤、纤维组织细胞肿
GFAP＋
胶质细胞肿瘤
果。 ③非特异性染色表现为无一定的分布规律。 ④非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，
有刀痕or组织折叠的部位。
1）、阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠， 坏死，挤压区，胶原结缔组织等 常表现为相同的阳性染色强度。
②四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
③四乙基罗达明（Teraethyle rhodamine B200, RB200） 590－600nm
3、胶体金： 指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， 对同一种物质的水溶液，粒子大小不同呈现的 颜色亦不同），5－60nm范围呈红色。
固定时间：8-24hr 组织大小：2*1.5*0.3cm
2、防脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。 3、增强特异性染色的措施和方法：
1）、蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%）；
b、胃蛋白酶消化（0.4%）。
2）、热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min；
直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
（ Neurofilament）
神经源性肿瘤， 嗜铬细胞瘤，
神经母细胞瘤，
神经节细胞瘤。
（二）、上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。 主要存在腺上皮来源的腺癌中。
前列腺特异性抗原（PSA）： 甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－
15min。在光镜下观察。 ⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝，
梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树 胶封固。
五、免疫组化常见问题的处理： 1、组织材料的处理：
常用的固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
蛋白表达的分布，定位，定量； 蛋白表达与疾病的关系； 蛋白表达与肿瘤生物学行为及预后关系等。
二、基本物质： （一）抗体：主要有两大类：
1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产
NSE＋or Sy ＋ NF－／＋ 节细胞神经母细胞瘤
这里必须强调免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则： ①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。 ②免疫组化不能用于良、恶性的判断。 ③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。 ④免疫组化染色不好时，or 出现相互矛盾的结果时， 要以形态学为准。
（三）、软组织标记 软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织， 肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。
肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中 肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种
可溶性蛋白，具有较高组织特异性。
内皮细胞标记CD34：主要标记内皮细胞； 亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。
（七）、癌基因，抑癌基因抗体： nm23：（转移抑制基因）定位于人类染色体17q22，
编码区为533bp，产物为152个氨基酸 组成的17KD 核内及胞浆蛋白，与二磷酸 核苷激酶（NDPK）的氨基酸序列具有高度同源性。 Nm23表达水平与肺癌转移能力呈负相关。
第 八 因 子 相 关 抗 原 （ Factor-Ⅷ-related antigen, FⅧRAg）：
血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。 CD34优于FⅧ-RAg。 溶菌酶（Lysozyme）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。 抗胰糜蛋白酶（AAcT）：主要用于恶纤组的诊断。
（四）、淋巴细胞标记物： 白细胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B细胞，
但利用新品红（New fuchsine）显色，可形成 不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。 HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，
不溶于有机溶剂，不褪色。
2、免疫荧光：通过荧光素标记抗体，借助荧光显微 镜观察荧光的发光物质。
①异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale, FITC） 520－530nm
（五）、神经内分泌标记物： 嗜铬素A（Chromogranin, CgA）：
存在于神经元，神经内分泌细胞及其肿瘤中。 突触素（Synaptophysin, Sy）：
生的抗体，可识别有限的抗原决定簇，特异 性强。
（二）显示物：
主要有： 1、酶标反应：
①碱性磷酸酶（Alkatine phasphoeroaidase, HRP)
AP与不同的底物作用，可形成不同颜色的终产物。 与萘酚（As-Mx）和快蓝（Fast blue）作用； 与快红（Fast red）作用。 缺点：形成的沉淀溶于有机溶剂。
三、主要方法： （一）、直接法： （二）、间接法：特点：是经过了第二抗体放大
效应 （三）、PAP法：以过氧化物酶和抗过氧化酶抗体
形成复合物，通过第二抗体的桥接与第 一抗体结合，然后以酶底物反应检出。
（四）、ABC法：
生物素（Biotin）和卵白素（Avidin）为具 有高度亲合性的物质，一个卵白素分子可结合4 个生物素。当生物素标上特定的标记物质后or与 抗体结合后仍能与卵白素结合，因此，将抗体结 合上生物素，然后与卵白素和带有特殊标记物的 生物素的结合反应，而以适当方式显示。
2）、对于阳性结果的定量判断： -，+，++，+++等分级和计数统计。
垂体腺瘤 ACTH
乳腺癌 ER
乳腺癌 c-erbB-2
六、免疫组化在病理诊断及鉴别诊断 和研究中的 应用
（一）、中间丝免疫组化的意义： 中间丝有五种：
分布部位 1、角蛋白 上皮组织（表皮，间皮
（Keratin） 消化道粘膜上皮，腺上皮，
存在于神经元突触前囊泡膜上，肾上腺髓质细胞， 神经内分泌细胞中。
髓磷脂硷性蛋白（Myelin basic protein, MBP）：
（六）、激素及激素受体类标记： 雄激素受体（Androgen receptor, AR）： 雌激素受体（Estrogen receptor, ER） 孕激素受体（Progesterone receptor, PR）： 垂体激素：
（五）、S-P法（LSAB）：
采用生物素标记的第二抗体与链霉素生物素蛋 白连接的过氧化物酶及基质素（底物）混合液来测 定细胞和组织中的抗原。
（六）、EnvisionⅠ法（二步法）：
原理：第二抗体上标记有多聚物酶（HRP or AP）复合物与第一抗体结合。二抗上的多聚物可 结合许多的HRP分子，使信号有显著提高，敏感 性较PAP法，ABC法高出几十倍，背景因多聚物葡 聚糖是人体内不存在，无非特异性干扰，尤其是 多聚物酶分子结合的第二抗体孵育时间短，该方 法更省时，简便。
keratinvimentin上皮性肿瘤keratin滑膜肿瘤vimentin间皮肿瘤上皮样肉瘤癌肉瘤desoractin肌源性肿瘤cd34or血管性肿瘤keratins100ormbp神经鞘膜瘤vimentinlca淋巴细胞aact骨肿瘤纤维组织细胞肿gfap胶质细胞肿瘤keratinnseorsyvimentinnf节细胞神经母细胞瘤这里必须强调免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则
内脏非角化上皮）
意义 癌
2 、波形蛋白 间叶组织（成纤维细胞，软
非肌源
（Vimentin） 骨细胞，巨噬细胞，内皮细胞， 性肉瘤
黑色素细胞等。
3、结蛋白
肌组织
肌源性肿瘤
（Desmin）
4、神经胶质纤 星型细胞，室管膜细胞 胶质瘤
维酸性蛋白
（GFAP）
5 、 神经丝 大部分中枢及外周神经元 交感，副交感
3）、合适的抗体稀释度： 过高，过低均会导致阴性结果。 即用型抗体； 浓缩型。
4、减少or 消除非特异性染色的方法： 非特异性染色： 原因： 方法：
5、对照： 阳性对照： 阴性对照：
6、免疫组化结果的判断： 特异性染色与非特异性染色鉴别点：
①特异性反应产物常分布于特定的部位， 具有结构性。 ②在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结
ACTH, GH, PRL, LH, TSH 主要用于垂体腺瘤的功能分类。 降钙素（Calcitotin, CT）： 甲状腺旁细胞（C细胞）分泌。
以上抗体及标记物主要用于疾病的病理诊断和鉴别诊断
其联合应用的作用和意义：
Keratin＋
Vimentin－
上皮性肿瘤
Keratin＋ Vimentin＋
免疫组织化学理论及技术
一、 免疫组织化学的基本概念：
组织化学：
免疫组织化学：是组织化学的一个分支即组 成部分，它以免疫学的抗原抗体反应基本原理为 其特点，同时还具备组织化学的一般特征。是指 应用免疫学原理，通过特异的抗原抗体反应，附 一可见的标志物，在组织原位显示抗原成分的方 法。
肿瘤及各种疾病的病理学研究概括起来主要 在基因和蛋白水平上进行的研究。
四、以LSAB法为例简单介绍染色步骤：
①石蜡切片脱蜡－水；
②3%H202抑制内源性过氧化物酶15min；
③每张切片加10-20ul非免疫性动物血清，室温孵 育5min；
④加特异性一抗，370C孵育30－60min，or 40C过 夜；
⑤加20ul生物素标记的第二抗体，370C，30min；
⑥加过氧化物酶标定的链菌素亲生物素，370C， 30min；
滑膜肿瘤 间皮肿瘤 上皮样肉瘤 癌肉瘤
Keratin－ Vimentin＋ 瘤
Keratin－ Vimentin－
Des＋or Actin＋ 肌源性肿瘤
CD34＋or FⅧ＋ 血管性肿瘤
S-100＋or MBP ＋ 神经鞘膜瘤
LCA＋
淋巴细胞
AACT＋ 骨肿瘤、纤维组织细胞肿
GFAP＋
胶质细胞肿瘤
果。 ③非特异性染色表现为无一定的分布规律。 ④非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，
有刀痕or组织折叠的部位。
1）、阳性细胞的染色特征： ①阳性细胞的染色分布有三种： 胞浆；细胞核；细胞膜表面 ②阳性细胞分布：灶性；弥漫性 ③染色强度不一 ④切片边缘，刀痕or组织折叠， 坏死，挤压区，胶原结缔组织等 常表现为相同的阳性染色强度。
②四甲基异硫氰酸罗达明（Teramethyle rhodamine isothiecyanata, TRITC） 620nm
③四乙基罗达明（Teraethyle rhodamine B200, RB200） 590－600nm
3、胶体金： 指金的水溶胶（以微小粒子分散在水溶液中， 对同一种物质的水溶液，粒子大小不同呈现的 颜色亦不同），5－60nm范围呈红色。
固定时间：8-24hr 组织大小：2*1.5*0.3cm
2、防脱片处理： 多聚-L-赖氨酸； 硫酸铬钾明胶液。 3、增强特异性染色的措施和方法：
1）、蛋白酶消化：a、胰蛋白酶消化 （0.05-0.1%）；
b、胃蛋白酶消化（0.4%）。
2）、热诱导的抗原修复： 方法：微波960C, 10min；
直接加温方法 1000C, 10min； 高压锅 1200C, 10min； 热处理液：0.01mol/L PH6.0 柠檬酸缓冲液
（ Neurofilament）
神经源性肿瘤， 嗜铬细胞瘤，
神经母细胞瘤，
神经节细胞瘤。
（二）、上皮性肿瘤标记 上皮膜抗原（EMA）： 广泛分布于各种正常上皮细胞膜及肿瘤中。 癌胚抗原（CEA）：主要存在于胎儿消化道上皮， 胰腺以及绝大部分内脏癌。 主要存在腺上皮来源的腺癌中。
前列腺特异性抗原（PSA）： 甲胎蛋白（AFP）： 甲状腺球蛋白（Tg）：
⑦以上每步后均用PBS液洗3×3min； ⑧用过氧化物酶基质液（DAB基质液）显色5－
15min。在光镜下观察。 ⑨自来水冲洗，苏木素浅染，自来水冲洗还蓝，
梯度酒精脱水，干燥，二甲苯透明，中性树 胶封固。
五、免疫组化常见问题的处理： 1、组织材料的处理：
常用的固定液为：10%中性福尔马林液； 4%多聚甲醛磷酸缓冲液（PH7.4）；
免疫组织化学方法主要用于基因蛋白质水平 表达的研究。
蛋白表达的分布，定位，定量； 蛋白表达与疾病的关系； 蛋白表达与肿瘤生物学行为及预后关系等。
二、基本物质： （一）抗体：主要有两大类：
1、多克隆抗体：为针对多个抗原决定簇的抗 体，为产生抗体的动物血清或免疫球蛋白。 2、单克隆抗体：为一个B淋巴细胞分化增殖产
NSE＋or Sy ＋ NF－／＋ 节细胞神经母细胞瘤
这里必须强调免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断原则： ①免疫组化用于病理诊断及鉴别诊断，必须以HE染色的
形态学为基础，免疫组化只能作为辅助手段。不能把 免疫组化染色作为诊断的“金标准”。 ②免疫组化不能用于良、恶性的判断。 ③免疫组化用于判断组织起源，分型，预后的估计。 ④免疫组化染色不好时，or 出现相互矛盾的结果时， 要以形态学为准。
（三）、软组织标记 软组织：全身各处的纤维结缔组织，脂肪组织， 肌肉组织，滑膜组织及血管淋巴组织。
肌动蛋白（Actin）：分布于所有的肌型细胞中 肌红蛋白（Myoglobin）：是骨骼肌肌浆中的一种
可溶性蛋白，具有较高组织特异性。
内皮细胞标记CD34：主要标记内皮细胞； 亦可用于各种肿瘤间质中血管生成的研究。
（七）、癌基因，抑癌基因抗体： nm23：（转移抑制基因）定位于人类染色体17q22，
编码区为533bp，产物为152个氨基酸 组成的17KD 核内及胞浆蛋白，与二磷酸 核苷激酶（NDPK）的氨基酸序列具有高度同源性。 Nm23表达水平与肺癌转移能力呈负相关。
第 八 因 子 相 关 抗 原 （ Factor-Ⅷ-related antigen, FⅧRAg）：
血管瘤阳性表达程度强于血管肉瘤。 CD34优于FⅧ-RAg。 溶菌酶（Lysozyme）：为组织细胞及其肿瘤的标记物。 抗胰糜蛋白酶（AAcT）：主要用于恶纤组的诊断。
（四）、淋巴细胞标记物： 白细胞共同抗原（LCA, CD45）：主要分布于T, B细胞，
但利用新品红（New fuchsine）显色，可形成 不溶于有机溶剂的红色沉淀，不褪色。 HRP：底物为DAB－四盐酸二氨基联苯胺，产生棕色沉淀，
不溶于有机溶剂，不褪色。
2、免疫荧光：通过荧光素标记抗体，借助荧光显微 镜观察荧光的发光物质。
①异硫氰酸荧光素（Fluorescien isothioyarale, FITC） 520－530nm