219457074_禽呼肠孤病毒蛋白p17_互作蛋白的筛选与鉴定

·研究论文·
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases
中国动物传染病学报摘 要：禽呼肠孤病毒（ARV ）p17蛋白在诱导细胞自噬和促进病毒复制中发挥重要作用，但与宿主细胞之间的相互关系及其致病机制尚不清楚。

本研究将ARV GX/2010/1株病毒液以104.3 TCID 50/0.2 mL 通过滴鼻点眼注射感染7日龄SPF 鸡。

应用Smart TM 技术构建该鸡肝组织cDNA 文库，且文库滴度达到2.6×107 CFU/mL 。

以p17为诱饵蛋白，利用酵母双杂交系统筛选得到16个互作候选克隆，经酵母回复验证得到9个阳性克隆并送至测序。

通过NCBI 和Uniport 等在线数据库比对分析得到PRPS2、IFI16、GTPBP4、IGF2BP1等胞内互作蛋白。

基因功能分析显示，这些蛋白参与宿主细胞先天免疫反应、RNA 的运输与翻译、结合核糖蛋白复合物、细胞粘附与迁移等生物学过程。

对这些互作蛋白的深入研究将为进一步了解ARV 及其p17蛋白致病的分子机制奠定基础。

关键词：禽呼肠病毒；p17蛋白；酵母双杂交；互作蛋白；蛋白分析
中图分类号：S852.65 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）02-0028-08
Screening and Identifi cation of the Protein P17 Interaction Proteins of Avian
Reovirus
ZHAO Fuxi, ZHANG Chengcheng, WANG Yanlong, YAN Kun, GUO Mengjiao, ZHANG Xiaorong,
WU Yantao
(College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
收稿日期：
2021-11-20基金项目：
国家蛋鸡产业技术体系建设专项经费（CARS-40-K16）；国家自然科学基金（31902299）；江苏省青年基金项目（BK20180924）
作者简介：
赵富熙，女，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：
吴艳涛，E-mail：************.cn 禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定
赵富熙，张成成，王延龙，鄢坤，郭梦娇，张小荣，吴艳涛
（扬州大学兽医学院，扬州225000）
2023,31(2):28-35Abstract: Previous studies have shown that the Avian Reovirus (ARV) p17 protein plays an important role in inducing cell autophagy and promoting virus replication. However, its interaction with host cells and pathogenic mechanism are still unclear. In this study, ARV GX/2010/1 virus solution was injected into 7-day-old SPF chickens with 104.3 TCID 50/0.2 mL through nasal dripping. The Smart TM technology was used to construct the chicken liver tissue cDNA library, which was determined to the titer of 2.6×107 CFU/mL. Using p17 as the bait protein, 16 candidate clones related to interaction were screened using the yeast two-hybrid system, and 9 positive clones were obtained by yeast response verifi cation and sequenced. Intracellular interacting proteins such as PRPS2, IFI16, GTPBP4, and IGF2BP1 were obtained through analysis of online databases such as NCBI and Uniport. Gene function analysis showed that these proteins were involved in biological processes such as host cell innate immune response, RNA transport and translation, binding to riboprotein complexes, cell adhesion and migration. The in-depth study of these interacting proteins would lay the foundation for further investigation of the molecular mechanism of ARV and its p17 protein.
Key words: Avian Reovirus; p17 protein; yeast two-hybrid; interacting protein; protein analysis
· 29 ·
赵富熙等：禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定第31卷第2期禽呼肠孤病毒（Avian Reovirus, ARV）是呼肠
孤病毒科正呼肠孤病毒属（Orthorevirus ）成员之一。

ARV是引起禽类疾病的重要病原体，与家禽病毒性关节炎/腱鞘炎、慢性呼吸系统疾病有关，雏鸡感染ARV后机体免疫功能降低，可能导致对大肠埃希氏杆菌、新城疫病毒等其他病原体的继发感染，特别是这种病毒具有免疫抑制作用[1]。

目前，对ARV感染引起机体的免疫抑制及发病分子机制仍不清楚。

因此，进一步阐明ARV感染的致病机理，对ARV的防控具有重要的指导意义。

先天性免疫在宿主对ARV的防御中起着重要作用，ARV感染早期激活先天性免疫系统并诱导天然免疫细胞因子，可能有助于ARV与宿主的相互作用[2]。

ARV S1基因的开放阅读框-1（ORF-1）编码合成非结构蛋白p17，p17蛋白是一种与其他任何病毒以及细胞蛋白都没有序列同源性并且在感染细胞的细胞核与细胞质中积累的核质穿梭蛋白，在ARV诱导细胞自噬和促进病毒复制中发挥重要作用[3]。

本实验室前期研究发现，ARV GX/2010/1株感染Vero细胞和原代鸡胚成纤维细胞后，引起细胞内双层膜囊泡的数量增加、GFP-LC3聚点形成和LC3II的增加，说明p17可以诱导细胞自噬；并且用自噬诱导剂雷帕霉素处理ARV感染细胞，可显著抑制ARV诱导的细胞凋亡，降低病毒复制水平；而用氯喹抑制自噬通路则降低病毒产量，证明细胞自噬可以促进ARV的复制，并且自噬水平与病毒的复制具有时间依赖性[4]。

虽然ARV p17蛋白已被证实可导致翻译停止、细胞周期阻滞和自噬小体形成，并促进病毒复制[5]
，但ARV p17蛋白与其靶细胞之间的相互作用，仍需进一步研究。

有研究通过p17与异质性核糖核蛋白HnRNP A1的相互作用发现，p17与HnRNP A1直接相互作用，并且HnRNP A1能够作为载体蛋白调节p17蛋白的核质穿梭[6]。

目前，有关ARV病毒蛋白与宿主细胞之间相互作用的研究也十分有限，其详细的分子作用机制也有待于进一步阐明。

酵母双杂交技术被广泛应用于两种蛋白质、蛋白质与核酸、蛋白质与其他小分子以及大规模蛋白质之间互作的研究。

本研究首先建立被ARV GX/2010/1株病毒感染鸡肝组织cDNA文库，并利用
酵母双杂交系统筛选出与ARV p17互作的宿主胞内蛋白，对这些蛋白进行生物信息学分析，为研究这些宿主蛋白在ARV致病过程中所发挥的作用，以及进一步深入阐明ARV抑制宿主免疫及病毒复制的分子机理提供了基础依据。

1 材料和方法
1.1 菌株、质粒及试剂 禽呼肠孤病毒ARV GX/2010/1株由本实验室保存；酵母表达菌株 Y2H Gold、Y187，酵母表达载体pGBKT7、pGADT7，质粒p G A D T 7-T 购自C l o n t e c h 公司；感受态细胞Trans1-t1、克隆载体pEASY-T3购自TransGen Biotech公司；Make You Own “Mate&Plate” Library System试剂盒、MatchmakerGold Yeast Two-Hybrid System试剂盒、DL2000 Marker、DNA Ladder Marker购自TaKaRa公司；限制性内切酶Bam HⅠ、
Eco RⅠ、Q5超保真DNA聚合酶均购自NEB公司；Taq 高保真DNA聚合酶、DNA T4 ligase购自TransGen
Biotech公司；SD/-Trp、SD/-Leu培养基、SD/-Trp/-Leu培养基、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基、AbA（金担子素）均购自Solarbio公司；动物组织RNA抽提试剂盒购自康为世纪；中提质粒提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自Axygen公司；酵母质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司；X-α-Gal购自YEASEN公司；DMSO购自Sigma公司。

1.2 构建被ARV 感染的鸡肝组织cDNA 文库 将ARV GX/2010/1株病毒液以104.3 TCID 50/0.2mL通过滴鼻点眼及足垫注射的途径感染7日龄SPF鸡。

接种7 d后，根据TRIzol Reagent试剂盒说明书，取50 mg被ARV GX/2010/1株感染的SPF鸡肝组织提取总RNA，通过紫外分光光度仪测定以及1.5%琼脂糖凝胶电泳对提取的总RNA进行鉴定。

利用Clontech公司Smart TM 技术，将2 μg细胞总RNA反转录为cDNA后，通过长距离PCR（long distance PCR, LD-PCR）扩增得到双链DNA（double-stranded, dsDNA），反应体系为：第一链cDNA 2 μL，ddH 2O 65 μL，Q5超保真DNA 聚合酶1 μL，5×Q5反应缓冲液20 μL，上、下游引物各2 μL。

上游引物序列为：5'-TTCCACCCAAGC AGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3'，下游引物序列为：5'-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCC
· 30 ·中国动物传染病学报2023年4月
GAGGCGGCCGACA-3'。

扩增程序为：98℃预变性30 s；98℃变性10 s，72℃延伸4 min，共30个循环；72℃再延伸10 min。

扩增后吸取7 μL扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

利用PEG/LiAc法，将dscDNA与线性化pGADT7-Rec载体共同转化至酵母感受态细胞Y187，涂布至100个SD/-Leu固体培养基上，30℃培养3 d后，将所有平板置于4℃冰箱预冷4 h，将所有菌落收集到含有25%甘油的YPDA液体培养基中，共500 mL（即cDNA文库）。

取100 μL稀释10倍的转化液涂布于SD/-Leu固体培养基上，30℃培养3 d，确定文库的库容。

1.3 重组诱饵质粒pGBKT7-p17的构建及自激活性与毒性检测 根据酵母表达载体pGBKT7的多克隆位点及NCBI中ARV p17基因编码序列，设计在其上、下游两端分别带有Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位点的特异性引物，（ARV-p17-F：GCGAATTCATGCAATG GCTCCGCCATACG；ARV-p17-R：GCGGATCCCTCA T G G A T C G G C G T C A A A T C G，下划线部分为B a m HⅠ和E c o RⅠ酶切位点）。

应用R T-P C R 扩增p17基因，PCR反应体系为（25 μL）：p17 cDNA 2 μL，ddH2O 17.25 μL，Taq高保真DNA聚合酶0.25 μL，10×反应缓冲液
2.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 2 μL，上、下游引物（ARV-p17-F、ARV-p17-R）各0.5 μL。

扩增程序为：94℃预变性10 min；94℃变性30 s，58℃复性30 s，72℃延伸27 s，共30个循环；72℃再延伸10 min。

通过同源重组将目的基因p17构建至pGBKT7空载体中，命名为pGBKT7-p17，并转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，提取经过卡那霉素抗性（50 μg/mL）筛选后的阳性克隆质粒，经酶切鉴定后，送至通用生物系统有限公司测序。

利用PEG/LiAc法制备酵母感受态细胞Y2H Gold，将构建成功的重组诱饵质粒pGBKT7-p17以及对照质粒酵母表达载体PGBKT7分别转化至酵母感受态细胞Y2H Gold，将稀释10倍后的转化液，分别以200 μL分别涂布于SD/-Trp固体培养基上，30℃培养3 d，观察并比较诱饵质粒与酵母空载体在相同的稀释度下的菌落数目以及形态大小，鉴定是否具有酵母毒性。

将已经构建好的重组诱饵质粒pGBKT7-p17转化至酵母感受态细胞Y2H Gold，将转化液以200 μL分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/Aba三种固体培养基上，30℃培养3 d，观察单菌落在培养基上是否生长及变蓝鉴定自激活性。

1.4 目的蛋白的筛选与初步鉴定 采用PEG/LiAc法将pGBKT7-p17转化至酵母感受态细胞Y2H Gold，并与1 mL已构建成功并转入酵母感受态细胞Y187的cDNA文库进行杂交，将两者混合并置于摇床中，30℃、50 rpm摇菌20~24 h。

然后将杂交液以200 μL 涂布于SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/Aba固体培养基上，置于30℃培养3 d，将蓝色单菌落挑取接种至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba固体培养基上，重复挑取3次，以排除假阳性克隆。

将阳性候选克隆接种于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade液体培养基中，30℃培养48 h，提取酵母质粒，再将所提取的酵母质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，提取经过卡那霉素抗性（50 μg/mL）筛选后的阳性克隆质粒。

将阳性质粒与诱饵质粒pGBKT7-p17各100 ng共转至Y2H Gold酵母感受态细胞中，以200 μL涂布于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba固体培养基，挑取蓝色阳性克隆提取酵母质粒，以该阳性质粒为模板，进行PCR 扩增（T7-F:TAATACGACTCACTATAGGGC；AD-R：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTAT CTACGATT），扩增产物连至pEASY-T3载体并送至公司测序，与NCBI BLAST数据库比对，得到与p17互作的宿主蛋白。

1.5 候选基因生物信息分析将获得的同源序列利用Uniprot（https://）和webgestalt （）在线分析网站进行Gene Ontology（GO）注释，明确筛选宿主蛋白功能及参与的生物学过程。

2 结果
2.1 cDNA文库的构建以及诱饵重组质粒的构建与检测 紫外分光光度仪测得鸡肝组织总RNA OD
260
/OD280为1.982，经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测可见28 s、18 s，两条清晰的条带，未见弥散条带，表明RNA质量良好且未发生明显降解（图1A）。

以RNA为模板合
· 31 ·
赵富熙等：禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定第31卷第2期成双链cDNA，其长度主要分布在250~2000 bp（图1B），说明cDNA质量较好，能够用于cDNA文库的构建。

利用RT-PCR方法扩增ARV p17基因，经2%
琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段约为441 bp（图2A）。

将p17基因连接至酵母表达载体pGBKT7，经限制性内切酶Bam HⅠ和Eco RⅠ双酶切（图2B）以及测序验证，说明重组载体构建成功。

图1 总RNA 和dsDNA 的PCR 电泳图Fig.1 PCR of total RNA and dsDNA
A: 总RNA PCR 电泳图. M1: DNA 相对分子量标准(DL2000); 1: 被ARV GX/2010/1株感染的鸡肝组织RNA 样品; A: dsDNA 的PCR 电
泳图. M2: DNA 相对分子量标准(DL5000); 2: PCR 扩增得到的dsDNA
A: PCR of total RNA; M1: DL2000 DNA marker; 1: RNA samples were extracted from chicken liver that infected with ARV strain
GX/2010/1; M2: DL5000 DNA marker; 2: PCR products of dsDNA 图2 p17基因的PCR 电泳图（A ）和重组质粒pGBKT7-p17的酶切图（B ）
F i g.2 PCR product of p17 gene (A) and the Restriction map of recombinant plasmid pGBKT7-p17 (B)
M: DNA 相对分子质量标准(DL2000); 1: PCR 扩增得到的P17基因; 2: 克隆载体pGBKT7酶切鉴定; 3: pGBKT7-p17诱饵表达载体酶
切鉴定
M: DL2000 DNA marker; 1: PCR products of p17 gene; 2: Enzymatic identifi
cation results of cloning vector pGBKT7; 3: Enzymatic identifi cation results of recombinant plasmid pGBKT7-p17
M 1
M1 2 M2
bp
bp bp
A
B
bp
A
M 1
bp
B
M 2 3
· 32 ·中国动物传染病学报2023年4月
将诱饵质粒pGBKT7-p17和对照质粒pGBKT7转化至酵母感受态细胞Y2H Gold，分别涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X、SD/-Trp/X/A固体培养基上培养，结果如图所示，诱饵质粒pGBKT7-p17在SD/-Trp/X固体培养基上可长出菌落，在SD/-Trp/X/A固体培养基上不能生长（图3A），说明诱饵质粒不具有自激活效应。

诱饵质粒pGBKT7-p17与酵母表达载体pGBKT7在SD/-Trp固体培养基上的单个菌落大小、形状基本一致，菌落数目无明显差别（图3B），说
明诱饵质粒对酵母细胞不具有毒性。

SD/-Trp/X
A B
S D/-Trp/X/A SD/-Trp pGBKT7空载体
图3 重组诱饵质粒的自激活检测（A ）和诱饵质粒毒性检
测（B ）
Fig.3 Auto-activation and toxicity tests (A) and
examination of the bait vector (B)
2.2 诱饵质粒pGBKT7-p17与被ARV 感染的鸡肝组织细胞cDNA 文库的酵母双杂交筛选及初步鉴定 将100个SD/-Leu固体培养基上所有酵母克隆（图4D）收集于冻存液中，共得到500 mL的文库菌液。

将稀释100倍后的文库菌液以100 μL涂布于SD/-Leu 固体培养基上，共到得114个克隆，文库滴度为2.6×107 CFU/mL。

将pGBKT7-p17转化至酵母感受态细胞Y2HGold，并与已构建成功并转化至酵母感受态细胞Y187的cDNA文库进行共培养，20 h后观察到酵母合子细胞（二倍体细胞，图4A），表明筛库过程正常；混合菌液在SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal/Aba 培养基上培养3 d后出现蓝色的酵母菌落（图4B），将蓝色单菌落转移至SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba培养基3 d，共重复筛选3次（图4C），得到16个候选阳性克隆。

对候选阳性克隆进行酵母回转验证，在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-Gal/Aba培养基上均出现蓝色克隆（图4E），并对阳性克隆进行PCR分析（图5）。

最终，以pGBKT7-p17为诱饵载体从被ARV感染的鸡肝组织cDNA文库中得到9种互作宿主蛋白（表1）。

图4 p17候选互作蛋白的筛选
Fig.4 Candidate interactio protein screening for p17
A: 24 h 酵母合子细胞观察, 箭头所指的为酵母合子细胞; B: DDO/X/A, SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA 培养基; C: QDO/X/A,SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA 培养基; D: 文库构建部分酵母克隆; E: pGBKT7-p17与部分候选蛋白体外互作的回补验证A: Vation of yeast zygote. Arrows indicate the yeast zygotes; B: DDO/X/A, SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA medium; C: QDO/X/A, SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X- α-Gal/AbA medium; D: Partial yeast cloning of cDNA Library Construction; E: Interaction validation
of pGBKT7-p17 and partial candidate proteins in vitr o
A
B C
E
D
· 33 ·
赵富熙等：禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定第31卷第2期图5 阳性克隆的 PCR 分析Fig.5 PCR detection of positive clones
M: DNA 相对分子质量标准(DL2000); 1~16: 候选蛋白的酵母菌落PCR 鉴定M: DL2000 DNA marker; 1-16: Yeast colonies PCR identifi cation of candidate proteins
表1 p17互作候选蛋白的GO 注释功能注释
Table 1 Gene Ontology annotation of p17 interacting candidate proteins
编号
Number 基因登录号GenBank number 蛋白名称Protein name
生物过程Biological process
1
NM_001006264.1
核糖磷酸焦磷酸激酶2Ribose-phosphate pyrophosphokinase 2（PRPS2）参与核苷酸的代谢与合成，参与5-磷酸核糖1-二磷酸生物合成，嘌呤核苷酸的合成 2NM_001131692.1
γ-干扰素诱导蛋白16 Gamma-interferon-inducible protein 16（IFI16）
激活先天免疫反应，与凋亡、自噬相关，与炎症反应免疫应答相关
3NM_001006354.1
核仁GTP 结合蛋白1
Nucleolar GTP-binding protein 1（GTPBP4）与细胞迁移、细胞粘附负调节，蛋白泛素化相关，参与细胞周期丝氨酸、丝氨酸蛋白激酶活性调节4AJ973596.1
聚谷氨酰胺结合蛋白1
Polyglutamine-binding protein 1（PQBP1）与核糖核蛋白复合物结合，具有转录辅激活因子活性
5NM_205071.1
胰岛素样生长因子2mRNA 结合蛋白1Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1（IGF2BP1）
参与RNA 的运输、翻译代谢、基因表达的调节，与神经系统的发育有关
6 NC_006098.5羧酸酯水解酶
Carboxylic ester hydrolase（CES1L2）脂质分解代谢过程
7NC_006100.5
成纤维细胞生长因子1
Fibroblast growth factor（FGF1）
激活蛋白激酶b 活性、
参与成纤维细胞生长因子受体信号通路
8NC_006093.5
3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸合酶
3'-phosphoadenosine-5'-phosphosulfate synthase （PAPSS2）血液凝固骨骼发育
3'-磷酸腺苷-5'-磷酸硫酸脂生物合成9NC_006089.5
钙黏蛋白-2
Cadherin-2（CDH2）
细胞粘附
2.3 生物信息学分析 GO注释分析表明与ARV p17互作的9种蛋白参与细胞的增殖与新陈代谢、刺激炎症反应等过程；分子功能包括蛋白、核酸、离子结合
以及调节水解活性、翻译活性等；9种蛋白存在于细胞核、细胞质中（图6）。

bp M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
· 34 ·中国动物传染病学报2023年4月
图6 GO 注释分析Fig.6 Gene Ontology
A: 生物过程; B: 细胞组成; C: 分子功能条形图的高度表示用户列表和类别中的id 数
A: Biological process; B: Cellular component; C: Molecular function
The height of the bar represents the number of IDs in the user list and also in the category
3 讨论
ARV编码的所有蛋白中，非结构蛋白p17与诱导宿主细胞自噬、凋亡和促进病毒复制相关。

前期研究发现ARV感染细胞后，细胞内转录组出现明显变化，包括大量有关免疫抑制基因的上调，表明ARV能够激活宿主天然免疫系统，引起细胞持续的抗病毒应答，从而影响细胞生长和细胞凋亡通路，通过p17入核对病毒增殖影响的实验发现，转染野生型p17再感染ARV后的病毒复制水平显著升高，说明p17可促进细胞自噬的同时促进病毒复制[7]。

酵母双杂交技术对研究蛋白的功能及解析其作用机制具有重要作用。

因此，为研究p17及其互作胞内蛋白在细胞凋亡、诱发细胞免疫抑制中的作用，本研究应用酵母双杂交技术，以ARV p17为诱饵蛋白从被ARV 感染的cDNA文库中筛选获得9种互作宿主蛋白。

核糖磷酸焦磷酸激酶2（Ribose-Phosphate Pyrophosphokinase 2, PRPS2），是细胞DNA合成的重要原料5-磷酸核糖-1-焦磷酸（5-phosphoribosyl 1-pyrophosphate, PRPP）合成的关键酶，在控制肿瘤发生、促进细胞凋亡以及抑制细胞增殖等方面具有重要作用。

下调PRPS2基因表达后，能够促进细胞增殖中DNA损伤，进而激发与DNA损伤修复相关的信号转导通路，诱导细胞凋亡发生[8]。

γ-干扰素诱导蛋白16（Interferon gamma-inducible protein 16,
IFI16）是一种干扰素诱导蛋白，可识别宿主细胞核中的病毒基因组，能够阻滞细胞周期进展，以促进细胞凋亡和老化来维持细胞正常生理功能，通过与控制细胞增殖及周期的多种蛋白结合，调控相应信号通路转导[9]。

近年来的研究发现，IFI16为HIV病毒感染的传感器，能有效的与CD4T细胞的dsDNA 结合。

IFI16不仅可在细胞核中识别、结合病毒基因组（如HSV-1、HCMV、KSHV、EBV），也可穿梭至细胞质中识别病毒核酸（HSV-1、HIV-1）[10]。

GTP结合蛋白4（Guanosine triphosphate binding protein 4, GTPBP4），是GTPBPS家族中的一员，定位于核仁的新型G蛋白，主要参与60S亚单位的合成和成熟，该蛋白与细胞增殖和生长密切相关。

有研究表明GTPBP4基因在胃癌组织和细胞中表达显著增强，能够通过调节p53活性而促进胃癌进展，其表达与肿瘤的侵袭转移相关[11]。

多谷氨酰胺结合蛋白1（Polyglutamine binding protein-1, PQBP1）是一种主要在淋巴和髓样细胞中表达的核蛋白，可以与含有多聚谷氨酰胺（Polyglutamine, PolyQ）区域的蛋白质结合，参与转录和RNA的修饰过程，已被证明能在逆转录病毒感染时导致Ⅰ型干扰素的产生[12]。

胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1（Insulin-like growth factor 2 mRNA-binding protein 1, IGF2BP1）是信使核糖核蛋白颗粒的组成成分，是一个保守的单链RNA结合蛋白家族。

· 35 ·
赵富熙等：禽呼肠孤病毒蛋白p17互作蛋白的筛选与鉴定
第31卷第2期IGF2BP敲除试验结果表明，其能介导β-actin mRNA 及其相关蛋白的转录，可能调控细胞代谢以及促进细胞的粘附和存活[13]。

成纤维细胞生长因子1（Fibroblast growth factor 1, FGF1），是生长因子家族中的一员，在胚胎发育、血管生长、创伤愈合等过程中发挥重要作用
[14]。

3'-磷酸腺苷-5'-磷酸
硫酸酯合成酶2（Phosphoadenosine-phosphosulfate synthetase 2, PAPSS2）是体内催化合成活性硫酸根供体的重要酶类基因，其活性对于正常骨骼发育很重要[15]。

钙粘蛋白2（Cadherin-2, CDH2）是一类依赖钙的细胞黏附分子，在固定的上皮组织中通过同性结合调节细胞-细胞黏附，在人类神经胶质瘤中，CDH2基因作为促癌基因异常高表达[16]。

介于酵母双杂存在一定的局限性，这些互作蛋白只是一个初步结果，接下来将选取与细胞自噬、免疫相关的蛋白作进一步互作验证及分析。

同时，这些蛋白也为揭示p17蛋白通过宿主蛋白引发细胞内信号转导的通路及其互作的胞内蛋白在细胞凋亡、诱发细胞免疫抑制中的作用提供了依据。

参考文献
[1] H uang L, Xie Z, Xie L, et al . A duplex real-time PCR
assay for the detection and quantification of avian reovirus and Mycoplasma synoviae[J]. Virol J, 2015(12): 22.[2] H uang W R, Chi P I, Chiu H C, et al . Avian reovirus p17 and
σA act cooperatively to downregulate Akt by suppressing mTORC2 and CDK2/cyclin A2 and upregulating proteasome PSMB6[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 5226.[3] C hiu H C, Huang W R, Liao T L, et al . Suppression of
Vimentin Phosphorylation by the Avian Reovirus p17 through Inhibition of CDK1 and Plk1 Impacting the G2/M Phase of the Cell Cycle[J]. PLoS One, 2016, 11(9): e0162356.
[4] M eng S, Jiang K, Zhang X, et al . Avian reovirus triggers
autophagy in primary chicken fibroblast cells and Vero cells to promote virus production[J]. Arch Virol, 2012, 157(4): 661-668.
[5] O gasawara Y, Ueda H, Kikuchi N, et al . Isolation and
genomic characterization of a novel orthoreovirus from a brown-eared bulbul (Hypsipetes amaurotis) in Japan[J]. J
Gen Virol, 2015, 96(Pt 7): 1777-1786.
[6] C hiu H C, Huang W R, Wang Y Y, et al . Heterogeneous
Nuclear Ribonucleoprotein A1 and Lamin A/C Modulate Nucleocytoplasmic Shuttling of Avian Reovirus p17[J]. J Virol, 2019, 93(20): e00851-19-.
[7] X ie L, Xie Z, Wang S, et al . Altered gene expression
profiles of the MDA5 signaling pathway in peripheral blood lymphocytes of chickens infected with avian reovirus[J]. Arch Virol, 2019, 164(10): 2451-2458.[8] L v Y, Wang X, Li X, et al . Nucleotide de novo synthesis
increases breast cancer stemness and metastasis via cGMP-PKG-MAPK signaling pathway[J]. PLoS Biol, 2020, 18(11): e3000872.
[9] C onnolly D J, Bowie A G. The emerging role of human
PYHIN proteins in innate immunity: Implications for health and disease[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 92(3): 405-414.
[10] D ell'Oste V, Gatti D, Giorgio A G, et al . The interferon-inducible DNa-sensor protein IFI16: a key player in the antiviral response[J]. New Microbiol, 2015, 38(1): 5-20.[11] L i L, Pang X, Zhu Z, et al . GTPBP4 Promotes Gastric
Cancer Progression via Regulating P53 Activity[J]. Cell Physiol Biochem, 2018, 45(2): 667-676.
[12] R ahman S K, Okazawa H, Chen Y W. Frameshift PQBP-1 mutants K192S and R153S implicated in X-linked intellectual disability form stable dimers[J]. J Struct Biol, 2019, 206(3): 305-313.
[13] H uang H, Weng H, Sun W, et al . Recognition of RNA
N6-methyladenosine by IGF2BP proteins enhances mRNA stability and translation[J]. Nat Cell Biol, 2018, 20(3): 285-295.
[14] B hushan B, Apte U. Liver Regeneration after Acetaminophen
H e p a t o t o x i c i t y : M e c h a n i s m s a n d T h e r a p e u t i c Opportunities[J]. Am J Pathol, 2019, 189(4): 719-729.[15] R amaswamy G, Sohn P, Eberhardt A, et al . Altered
responsiveness to TGF-β results in reduced Papss2 expression and alterations in the biomechanical properties of mouse articular cartilage[J]. Arthritis Res Ther, 2012, 14(2): R49.
[16] T sai T Y, Sikora M, Xia P, et al. An adhesion code ensures
robust pattern formation during tissue morphogenesis[J]. Science, 2020, 370(6512): 113-116.。