第四十四章 重组DNA技术
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将外源序列或目的基因插入载体，主要是 靠DNA连接酶和其他工具酶的配合使用。 根据末端的性质，它们的连接方式主要有 三种：
① 载体和目的基因具有相同的粘性末端 ② 载体和目的基因均为平端； ③ 载体和目的基因各有一个粘性末端和一个平端
选择哪一种连接方式主要取决于载体的性质 （特别是MCS的性质）和目的基因的来 4. 制备转基因动物和植物 5. 基因治疗 6. 基因敲除 7.到某种载体上能够代 表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的DNA 片段的集合。根据序列的来源，可分为基因 组和cDNA。
根据治疗的细胞对象，基因治疗分为性细胞基因治疗 和体细胞基因治疗两种类型。性细胞基因治疗，是在 患者的性细胞中进行操作，用来彻底根除并使其后代 从此再也不会得这种遗传疾病。然而，由于目前的技 术水平有限，难以解决关键的基因定点整合（或称基 因打靶）问题，加之相关的伦理学问题，以及愿意接 受治疗的志愿患者甚少，还不能进入临床试验。
改造蛋白质的主要手段是体外突变。突变有 随机突变和定点突变。无论是何种突变，最 后都面临一个筛选的问题。现在有两种非常 有用的筛选方法，一个是噬菌体展示，另一 个就是核糖体展示
寡核苷酸引导的定点突变
基因混排
也叫基因改组，实际上是一种体外同源重组技 术。具体操作是将来源不同但功能相同的一组 同源基因（来源于不同物种的同源基因或含有 不同突变的基因），用DNA 酶I 当一个基因拷贝片 段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换， 重组从而发生，导入体内后， 选择正突变体作 为新一轮的体外重组。
物种，组织，不同的发育阶段 0.2kb~6kb
代表性 类型 探针 用途
均等
与表达水平有关
只有一种
两种（表达型和非表达型）
DNA
DNA、蛋白质或抗体
基因结构，推断蛋白质性质 表DNA序列分析的基本流程
克隆基因在宿主细胞中的表达
要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基 因亚克隆到带有基因表达所必需的各种元件的载体之 中，这些载体通称为表达载体。目的基因可以放在不 同的宿主细胞中表达。针对不同的表达系统，需要构 建不同的表达载体。
蓝白筛选法图解
基因克隆的详细步骤
1. 获得外源DNA序列和目的基因； 2. 将目的基因与载体相连； 3. 将重组体导入特定的宿主细胞； 4. 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。
获取目的基因的手段
1. 人工合成 2. 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆
载体中释放出来 3. 反转录 4. PCR
目的基因与载体的连接
重组DNA技术的基本步骤
基因克隆的载体
载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们 带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。
一种理想的载体至少包括：
① 大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核 系统中的扩增；
② 某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核 细胞内的自主复制；
培育转基因动物的基本步骤
1. 准备供体动物，分离受精卵； 2. 准备注射用转基因DNA溶液； 3. 将转基因DNA显微注射到一个受精卵的雌
性原核之中，进入的DNA通过非同源重组 插入到基因组之中； 4. 将受精卵移植到代孕母鼠的子宫之中； 5. 对出生的小鼠进行筛选，挑出转基因小鼠。
基因治疗
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通 过一定方式导入人体靶细胞，表达有功能的蛋白质， 以纠正目的基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到 治病目的的一种治疗方法。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
1. 转化 2. 转染 3. 电穿孔 4. 脂质体介导 5. 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
直接筛选
① 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 ② 根据营养需要进行筛选 ③ 根据噬菌斑类型进行筛选 ④ 蓝白斑选择
间接筛选
① 核酸杂交法 ② PCR法 ③ 免疫化学 ④ 受体/配体的结合性质 ⑤ Southwestern/Northwestern ⑥ DNA限制性内切酶图谱分析 ⑦ DNA序列分析
表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在 插入位点上“预装”了另外一个蛋白质或多肽的基因， 因此，插入的外源基因将会与它发生融合，表达出来 的是一种融合蛋白。使用融合载体的主要好处是方便 了目的蛋白的纯化。
理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具 有合适的MCS，以便使外源基因能够插入到正确的表 达位置，或者至少是含有3个以上阅读框架的系列； （2）能够形成正确的翻译后修饰和三维结构，以形成 有活性的或有功能的分子；（3）为可诱导的表达系统， 允许细胞生长和诱导表达，防止毒性蛋白质的积累； （4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。
根据治疗途径，基因治疗可分为体内基因治疗和回体 基因治疗。
基因敲除
基因敲除是上个世纪80年代后半期随DNA 同源重组原理发展起来的一门新技术，它 是指在分子水平上，使用特定的手段，将 一个结构已知但功能不详的基因去除，或 用其他顺序相近的基因取代，使原基因功 能丧失，然后从整体观察实验动物的表型 变化，进而推断相应基因的功能。这与早 期生理学研究中常用的切除部分-观察整体 -推测功能的思路相似。
II类限制性内切酶的三种切割方式
黏端之间的退火
宿主细胞
宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。 理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为 常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的 培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较 了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核 宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜 蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒 载体。
2. Ⅱ类：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+， 但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位 点内部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；
3. Ⅲ类与Ⅰ类相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围 25bp~30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克 隆，通常在重组DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
③ 含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点择性标记，有利于克隆的筛 选和鉴别；
⑤ 某些载体含有可诱导的或组织特异性的启动子或增强表达；
⑥ 现代的载体一般含有多功能的结构元件，同时兼顾到克隆、 DNA测序、体外突变、转录和自主复制。
限制性内切酶
限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异 性的DNA内切酶，它们识别双链DNA分子内部特殊的 碱基序列（通常为4~6 bp的回文序列），切开DNA的 两条链，产生特定的末端。
已发现三类限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活 性关系和切割性质上有如下差别：
1. Ⅰ类：由3种不同的亚基组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内 切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机 切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围 400~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
pUC18/19质粒的基本结构
λ噬菌体载体的构建、重组和包装
细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入
酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入
将外源基因或序列导入载体的工具
将外源基因或序列导入到载体需要特殊的工 具酶，其中以限制性内切酶（RE）和连接酶 最为重要，此外，有时还需要DNA聚合酶、 多聚鉴定出特定的循环组成（30~40次），每循环 一次，DNA复制一次。每一个循环由三步反应组成： （1）DNA变性—采取热变性，使模板DNA在95℃左 右的高温下解链；（2）退火—降低温度（通常在 50℃– 65℃），以使引物与模板DNA配对；（3）延 伸反应—在DNA聚合酶催化下的，在引物的3′端合成 DNA，温度通常在72℃左右。
胰岛素在大肠杆菌体内的表达
凝血因子VIII高表达载体的构建和及其原理
转基因动物和植物
克隆的基因不仅可以导入细菌或培养的细 胞，而且能转入动植物体内，整合到基因 组内，使其所有的细胞都带有特定的外源 基因，从而根本上改变其遗传特性。转基 因动物或转基因植物就是指在其基因组内 稳定地整合有外源基因、并能遗传给后代 的动物或植物。
聚合酶链式反应（PCR）
PCR是由Kary Mullis于1984年发明的一种简单、快速、 灵敏地在体外选择和特异性扩增特定DNA序列或片 段的方法。
PCR的原理并不复杂：理论上，DNA分子数目经复 制呈指数增长，如果提供足够的引物和dNTPs，1分 子DNA复制n次后，可产生2n个DNA分子。但与体内 DNA复制不一样的是：PCR的解链反应使用的是热 变性，而不是解链酶；PCR使用的引物是人工合成寡 聚DNA，而不是像体内由引发酶合成的RNA；为了 增加DNA聚合酶的稳定性，PCR使用的是耐热的 DNA聚合酶。
基因混排
PCR突变的基本流程
使用同源重组进行基因敲除的基本步骤
基因敲减（gene knockdown）
基因敲减也称为基因抑制，是一项降低或者抑制 一种生物的某个或者某些基因表达的技术，以区 别传统的“基因敲除”。敲减的手段可以在DNA 水平上，通过对DNA 的修饰来抑制基因的转录， 也可以使用人工设计的核酶（主要是锤头核酶）， 定向切割特定的目标基因转录出来的mRNA，或 者在翻译水平上，通过RNAi 技术或者依赖于核糖 核酸酶H 的反义核酸技术，来抑制特定mRNA 的 翻译。如果是在DNA 水平上进行基因敲减，就可 以将其与转基因技术结合起来，得到转基因敲减 生物。
第四十四章 重组DNA技术
提纲
一． 重组DNA技术简介 二． 基因克隆的详细步骤 三． 基因克隆的应用 四． 聚合酶链式反应 五． 蛋白质工程 六． 研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法 七． 研究蛋白质之间相互作用的主要方法 八． SELEX技术 九． 生物芯片技术 一○．基因组编辑技术
重组DNA
重组DNA也称为基因克隆或分子克隆，是通过 某种手段将不同来源的DNA片段连接起来形成 嵌合体分子，并进行扩增和纯化以供进一步研 究的技术。
有效的基因克隆至少满足五个条件：（1）具 有容纳外源基因或序列的载体；（2）具有将 外源基因或序列导入载体的工具；（3）具有 合适的宿主细胞；（4）具有将重组DNA引入 到宿主细胞的途径；（5）具有选择和筛选重 组体的方法。
聚合酶链式反应的基本过程
PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析
蛋白质工程
蛋白质工程就是使用遗传和化学手段，从改 变或合成基因入手，改变一种蛋白质的结构 与功能，从而产生具有特殊的、符合人们意 愿性质的新产物的一项技术。。
蛋白质工程的目的：（1）改变催化性质。 （2）改变结构性质；（3）创造新系统。
未知基因的寻找
1. 从基因的终产物开始鉴定新基因 2. 从核酸水平上寻找新基因 3. 根据同源序列搜索和寻找 4. 基因标签法 5. 消减杂交技术。 6. 差异显示PCR技术 7. RNA随机引物聚合酶链式反应 8. 外显子捕获。 9. 与CG岛有关的技术 10. 噬菌体展示 11. 酵母双杂交系统
① 载体和目的基因具有相同的粘性末端 ② 载体和目的基因均为平端； ③ 载体和目的基因各有一个粘性末端和一个平端
选择哪一种连接方式主要取决于载体的性质 （特别是MCS的性质）和目的基因的来 4. 制备转基因动物和植物 5. 基因治疗 6. 基因敲除 7.到某种载体上能够代 表所有可能序列并且可以稳定维持和使用的DNA 片段的集合。根据序列的来源，可分为基因 组和cDNA。
根据治疗的细胞对象，基因治疗分为性细胞基因治疗 和体细胞基因治疗两种类型。性细胞基因治疗，是在 患者的性细胞中进行操作，用来彻底根除并使其后代 从此再也不会得这种遗传疾病。然而，由于目前的技 术水平有限，难以解决关键的基因定点整合（或称基 因打靶）问题，加之相关的伦理学问题，以及愿意接 受治疗的志愿患者甚少，还不能进入临床试验。
改造蛋白质的主要手段是体外突变。突变有 随机突变和定点突变。无论是何种突变，最 后都面临一个筛选的问题。现在有两种非常 有用的筛选方法，一个是噬菌体展示，另一 个就是核糖体展示
寡核苷酸引导的定点突变
基因混排
也叫基因改组，实际上是一种体外同源重组技 术。具体操作是将来源不同但功能相同的一组 同源基因（来源于不同物种的同源基因或含有 不同突变的基因），用DNA 酶I 当一个基因拷贝片 段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换， 重组从而发生，导入体内后， 选择正突变体作 为新一轮的体外重组。
物种，组织，不同的发育阶段 0.2kb~6kb
代表性 类型 探针 用途
均等
与表达水平有关
只有一种
两种（表达型和非表达型）
DNA
DNA、蛋白质或抗体
基因结构，推断蛋白质性质 表DNA序列分析的基本流程
克隆基因在宿主细胞中的表达
要使克隆基因在宿主细胞中表达，首先需要将目的基 因亚克隆到带有基因表达所必需的各种元件的载体之 中，这些载体通称为表达载体。目的基因可以放在不 同的宿主细胞中表达。针对不同的表达系统，需要构 建不同的表达载体。
蓝白筛选法图解
基因克隆的详细步骤
1. 获得外源DNA序列和目的基因； 2. 将目的基因与载体相连； 3. 将重组体导入特定的宿主细胞； 4. 目的基因序列克隆的筛选与鉴定。
获取目的基因的手段
1. 人工合成 2. 使用酶切将目的基因直接从另一种克隆
载体中释放出来 3. 反转录 4. PCR
目的基因与载体的连接
重组DNA技术的基本步骤
基因克隆的载体
载体的作用是容纳被克隆的目标基因，以便将它们 带入到特定的宿主细胞中进行扩增或表达。
一种理想的载体至少包括：
① 大多数载体含有原核细胞DNA复制起始区，以便于在原核 系统中的扩增；
② 某些载体还含有真核细胞DNA复制起始区，以方便在真核 细胞内的自主复制；
培育转基因动物的基本步骤
1. 准备供体动物，分离受精卵； 2. 准备注射用转基因DNA溶液； 3. 将转基因DNA显微注射到一个受精卵的雌
性原核之中，进入的DNA通过非同源重组 插入到基因组之中； 4. 将受精卵移植到代孕母鼠的子宫之中； 5. 对出生的小鼠进行筛选，挑出转基因小鼠。
基因治疗
基因治疗是指将人的正常基因或有治疗作用的基因通 过一定方式导入人体靶细胞，表达有功能的蛋白质， 以纠正目的基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到 治病目的的一种治疗方法。
将重组DNA引入到宿主细胞的途径
1. 转化 2. 转染 3. 电穿孔 4. 脂质体介导 5. 弹道基因转移
重组体的选择和筛选
直接筛选
① 根据抗生素敏感性和抗性变化进行筛选 ② 根据营养需要进行筛选 ③ 根据噬菌斑类型进行筛选 ④ 蓝白斑选择
间接筛选
① 核酸杂交法 ② PCR法 ③ 免疫化学 ④ 受体/配体的结合性质 ⑤ Southwestern/Northwestern ⑥ DNA限制性内切酶图谱分析 ⑦ DNA序列分析
表达载体可分为融合载体和非融合载体两类，前者在 插入位点上“预装”了另外一个蛋白质或多肽的基因， 因此，插入的外源基因将会与它发生融合，表达出来 的是一种融合蛋白。使用融合载体的主要好处是方便 了目的蛋白的纯化。
理想的表达系统应该满足以下条件：（1）表达载体具 有合适的MCS，以便使外源基因能够插入到正确的表 达位置，或者至少是含有3个以上阅读框架的系列； （2）能够形成正确的翻译后修饰和三维结构，以形成 有活性的或有功能的分子；（3）为可诱导的表达系统， 允许细胞生长和诱导表达，防止毒性蛋白质的积累； （4）易于分离和纯化；（5）最好能分泌到胞外。
根据治疗途径，基因治疗可分为体内基因治疗和回体 基因治疗。
基因敲除
基因敲除是上个世纪80年代后半期随DNA 同源重组原理发展起来的一门新技术，它 是指在分子水平上，使用特定的手段，将 一个结构已知但功能不详的基因去除，或 用其他顺序相近的基因取代，使原基因功 能丧失，然后从整体观察实验动物的表型 变化，进而推断相应基因的功能。这与早 期生理学研究中常用的切除部分-观察整体 -推测功能的思路相似。
II类限制性内切酶的三种切割方式
黏端之间的退火
宿主细胞
宿主细胞是接受、扩增和表达重组DNA的场所。 理论上，任何活细胞都可以作为宿主细胞，但最为 常用的宿主细胞有大肠杆菌、酵母、草地贪夜蛾的 培养细胞和哺乳动物的培养细胞等。
大肠杆菌是最常用的原核宿主菌，原因是对它比较 了解，操作起来也特别容易。酵母是最常用的真核 宿主细胞，其很多性质与大肠杆菌相似；草地贪夜 蛾的培养细胞专门用来接受改造过的昆虫杆状病毒 载体。
2. Ⅱ类：不具有修饰酶活性，只由一条肽链组成，需要Mg2+， 但不需要SAM和ATP，其切割DNA特异性最强，且在识别位 点内部切断DNA，93%的限制性内切酶属于此类；
3. Ⅲ类与Ⅰ类相似，需要Mg 2+和ATP，但切点在识别序列周围 25bp~30bp范围内。显然，II类限制性内切酶最适合于基因克 隆，通常在重组DNA技术中提到的限制性内切酶都属于此类。
③ 含有集中了多种常用的限制性内切酶切点的多克隆位点择性标记，有利于克隆的筛 选和鉴别；
⑤ 某些载体含有可诱导的或组织特异性的启动子或增强表达；
⑥ 现代的载体一般含有多功能的结构元件，同时兼顾到克隆、 DNA测序、体外突变、转录和自主复制。
限制性内切酶
限制性内切酶实际上是一类特殊的具有高度位点特异 性的DNA内切酶，它们识别双链DNA分子内部特殊的 碱基序列（通常为4~6 bp的回文序列），切开DNA的 两条链，产生特定的末端。
已发现三类限制性内切酶，它们在组成、与修饰酶活 性关系和切割性质上有如下差别：
1. Ⅰ类：由3种不同的亚基组成，兼有修饰酶和依赖于ATP的内 切酶活性，它能识别和结合于特定的DNA序列位点，但随机 切断在识别位点以外的DNA序列（通常在识别位点周围 400~700bp）。这类酶的作用需要Mg2+、SAM及ATP；
目前使用的载体多衍生于质粒、噬菌体和病毒。
pUC18/19质粒的基本结构
λ噬菌体载体的构建、重组和包装
细菌人工染色体的结构和外源DNA的插入
酵母人工染色体的结构和外源DNA的插入
将外源基因或序列导入载体的工具
将外源基因或序列导入到载体需要特殊的工 具酶，其中以限制性内切酶（RE）和连接酶 最为重要，此外，有时还需要DNA聚合酶、 多聚鉴定出特定的循环组成（30~40次），每循环 一次，DNA复制一次。每一个循环由三步反应组成： （1）DNA变性—采取热变性，使模板DNA在95℃左 右的高温下解链；（2）退火—降低温度（通常在 50℃– 65℃），以使引物与模板DNA配对；（3）延 伸反应—在DNA聚合酶催化下的，在引物的3′端合成 DNA，温度通常在72℃左右。
胰岛素在大肠杆菌体内的表达
凝血因子VIII高表达载体的构建和及其原理
转基因动物和植物
克隆的基因不仅可以导入细菌或培养的细 胞，而且能转入动植物体内，整合到基因 组内，使其所有的细胞都带有特定的外源 基因，从而根本上改变其遗传特性。转基 因动物或转基因植物就是指在其基因组内 稳定地整合有外源基因、并能遗传给后代 的动物或植物。
聚合酶链式反应（PCR）
PCR是由Kary Mullis于1984年发明的一种简单、快速、 灵敏地在体外选择和特异性扩增特定DNA序列或片 段的方法。
PCR的原理并不复杂：理论上，DNA分子数目经复 制呈指数增长，如果提供足够的引物和dNTPs，1分 子DNA复制n次后，可产生2n个DNA分子。但与体内 DNA复制不一样的是：PCR的解链反应使用的是热 变性，而不是解链酶；PCR使用的引物是人工合成寡 聚DNA，而不是像体内由引发酶合成的RNA；为了 增加DNA聚合酶的稳定性，PCR使用的是耐热的 DNA聚合酶。
基因混排
PCR突变的基本流程
使用同源重组进行基因敲除的基本步骤
基因敲减（gene knockdown）
基因敲减也称为基因抑制，是一项降低或者抑制 一种生物的某个或者某些基因表达的技术，以区 别传统的“基因敲除”。敲减的手段可以在DNA 水平上，通过对DNA 的修饰来抑制基因的转录， 也可以使用人工设计的核酶（主要是锤头核酶）， 定向切割特定的目标基因转录出来的mRNA，或 者在翻译水平上，通过RNAi 技术或者依赖于核糖 核酸酶H 的反义核酸技术，来抑制特定mRNA 的 翻译。如果是在DNA 水平上进行基因敲减，就可 以将其与转基因技术结合起来，得到转基因敲减 生物。
第四十四章 重组DNA技术
提纲
一． 重组DNA技术简介 二． 基因克隆的详细步骤 三． 基因克隆的应用 四． 聚合酶链式反应 五． 蛋白质工程 六． 研究核酸与蛋白质相互作用的主要方法 七． 研究蛋白质之间相互作用的主要方法 八． SELEX技术 九． 生物芯片技术 一○．基因组编辑技术
重组DNA
重组DNA也称为基因克隆或分子克隆，是通过 某种手段将不同来源的DNA片段连接起来形成 嵌合体分子，并进行扩增和纯化以供进一步研 究的技术。
有效的基因克隆至少满足五个条件：（1）具 有容纳外源基因或序列的载体；（2）具有将 外源基因或序列导入载体的工具；（3）具有 合适的宿主细胞；（4）具有将重组DNA引入 到宿主细胞的途径；（5）具有选择和筛选重 组体的方法。
聚合酶链式反应的基本过程
PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析
蛋白质工程
蛋白质工程就是使用遗传和化学手段，从改 变或合成基因入手，改变一种蛋白质的结构 与功能，从而产生具有特殊的、符合人们意 愿性质的新产物的一项技术。。
蛋白质工程的目的：（1）改变催化性质。 （2）改变结构性质；（3）创造新系统。
未知基因的寻找
1. 从基因的终产物开始鉴定新基因 2. 从核酸水平上寻找新基因 3. 根据同源序列搜索和寻找 4. 基因标签法 5. 消减杂交技术。 6. 差异显示PCR技术 7. RNA随机引物聚合酶链式反应 8. 外显子捕获。 9. 与CG岛有关的技术 10. 噬菌体展示 11. 酵母双杂交系统