大脑皮层厚度的测定

肝硬化大鼠模型脑组织形态变化及机制
刘洪艳1△,王静艳1,王伟2,刘沛1
(1.中国医科大学附属第二医院感染科,辽宁沈阳110004; 2.沈阳市第六人民医院一病房)
【摘要】目的:探讨肝硬化时脑组织形态改变及其发生机制。

方法:应用计算机扫描技术对16只应用四氯化碳腹腔注射12周制备肝硬化模型的大鼠和9只正常大鼠的大脑皮层的厚度进行计算,同时应用T UNE L方法和苏木素复染后计数大鼠脑细胞凋亡情况。

结果:肝硬化动物模型的血氨为(231.80±24.17)μmmol/L,明显高于正常大鼠(48.7±5.87)μmmol/L。

肝硬化动物模型大脑皮质的厚度为(215.03±14.94)μm,正常大鼠大脑皮质厚度为(248.35±19.82)μm,P<0.01;脑细胞凋亡指数(0.29±0.11)较正常大鼠(0.03±0.02)明显增高,P<0.05。

脑细胞凋亡指数与血氨的水平呈正相关。

结论:氨可能诱发肝硬化大鼠脑发生形态变化,脑神经细胞凋亡可能是这种变化的基础。

【关键词】肝硬化;肝性脑病;神经细胞凋亡;血氨
【中图分类号】R575.2 【文献标识码】A 【文章编号】0258-4646(2005)04-0309-02
H istopa tholog i ca l changes of the bra i n and its m echan is m i n li ver c i rrhosis m odel of ra ts
L I U Hong2yan1△,WANG J ing2yan2,WANG W ei2,L I U Pei1
(1.Depart m ent of I nfecti ous D iseases,The Second Affiliated Hos p ital,China Medical University,Shenyang110004,China;
2.The FirstW ard,The Sixth Peop le Hos p ital of Shenyang)
【Abstract】　O bjecti ve:To study the hist opathol ogical changes of the brain and itsmechanis m in liver cirrhosismod2 el of rats.M ethods:The liver cirrhosis models of ratswere made by injecting carbon tetrachl oride int o the abdom inal cavity f or12weeks.The thickness of the cortex was measured by computer scanning in16liver cirrhosis models of rats and9nor2 mal rats.The apop t osis of brain cells in liver cirrhosis models was detected by T UNE L staining.Results:The level of bl ood a mmonia in liver cirrhosis models of rats was much higher than that in nor mal rats[231.80±24.17(S D)μmmol/L vs.48.70±5.87μmmol/L,P<0.05].The thickness of cortex in liver cirrhosis models of rats was l ower than those in nor mal rats(215.03±14.94μm vs.248.35±19.82μm,P<0.01).The apop t osis index of brain cells in liver cir2 rhosis models of rats was larger than that in nor mal rats(0.29±0.11vs.0.03±0.02,P<0.05).The apop t osis index of brain cells correlated positively t o the level of bl ood a mmonia.Conclusi on:Ammonia may induce the hist opathol ogical changes of the brain in rats with liver cirrhosis and the apop t osis of brain cells may be the f oundati on of these changes.
【Key words】　liver cirrhosis;hepatic encephal opathy;neur ocyte apop t osis;bl ood a mmonia
部分肝硬化病人可以发生与年龄不符的记忆力减退、行动迟缓等大脑退行性改变,甚至痴呆,这可能是肝性脑病(hepatic encephal opathy,HE)的一种早期表现。

本研究采用四氯化碳(CCL
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)制备大鼠肝硬化动物模型,观察大鼠脑组织形态及神经细胞凋亡的情况,并测定血氨水平以探讨氨在肝性脑病的发生中的作用及机制。

1　材料与方法
1.1　实验动物　选择健康雄性W istar大鼠40只,体重180～220g(中国医科大学附属第二医院动物
【收稿日期】2004-12-30
【基金项目】辽宁省自然科学基金项目(96221)
△研究生,现在沈阳市第六人民医院十病房室提供)。

1.2　药品及仪器　分析纯四氯化碳,橄榄油。

血氨检测试剂盒(美中互利工业公司)。

细胞凋亡检测试剂盒(武汉-博士德生物工程公司)。

显微成像系统(日本奥林帕斯公司)。

计算机图像分析系统。

1.3　实验方法
1.3.1　肝硬化模型制备:大鼠30只,给予CCl4400 m l/L橄榄油0.2m l/kg,i p,每周2次,共12周;对照组10只大鼠给予同等量的橄榄油i p,每周2次,共12周。

期间,观察大鼠的毛色、状态、体重。

1.3.2　标本的采取与制备:动物模型制备后,应用角膜反射及翻转反射的存在与否判断是否伴有HE 的发生[1]。

各组大鼠用抗凝管采血应用vitr os A2 MON干片比色法检测血氨。

处死后立即取大脑及肝右叶组织并固定。

常规染色光镜下观察肝脏和脑
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中国医科大学学报　J Chin Med Univ　第34卷　第4期　2005年8月
组织的形态改变。

1.3.3　大脑皮质厚度的测定:对HE染色的脑组织应用计算机图像分析系统,选择大脑皮、髓质交界分明的部位,检测3次,平均值视为大脑皮质的厚度。

1.3.4　脑细胞凋亡检测应用脱氧核苷酸切口末端标记(T UNE L)法:操作方法参照武汉博士德生物试剂盒进行。

脑组织常规固定、包埋、制备切片。

脱蜡后,用3%H
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O2阻断内源性过氧化氢酶(per oxidase, P OD)活性,再依次用T UNE L反应液和P OD标记的亲和素标记,最后用DAB显色,显微镜观察染色结果。

细胞核呈棕褐色者为阳性细胞。

凋亡指数(apop t otic index,A I)的计算:于400倍光镜下从细胞数最多的视野开始,计数每个视野阳性细胞占细胞总数的百分数,从上到下,从左到右的顺序计数,共计10个视野1000个细胞,然后计算平均值。

114　统计学处理　所有实验数据以 x±s表示,肝硬化组、对照组血氨的比较应用方差分析,P<0.05具有统计学意义。

肝硬化组与对照组血氨比较、两组A I比较分别采用t检验,P<0.05具有统计学意义。

2　结果
2.1　肝硬化模型组共有16只存活,毛色黯淡,体重在0～4周增加,4～8周下降,8～12周体重又有所增加;大鼠的活动迟缓,反应迟钝,进食量也少;有3只大鼠角膜反射与翻转反射消失,证明出现肝性脑病;共有11只大鼠有腹水形成。

显微镜下观察:肝硬化组大鼠均有肝小叶结构破坏,有明显硬化结节形成;各组脑组织切片普通光镜下均未见明显异常。

2.2　肝硬化组血氨为(231.80±24.17)μmol/L,正常对照组血氨为(48.70±5.87)μmol/L,二者比较有显著差异(P<0.05)。

2.3　肝硬化组脑皮质厚度为(215.03±14.94)μm,正常对照组为(248.35±19.82)μm,两组比较有非常显著差异(P<0.01)。

2.4　正常对照组仅可见个别细胞发生凋亡,A I为0.03±0.02;肝硬化组可见明显的细胞凋亡,A I为0.29±0.11;二者比较具有非常显著性差异(P< 0.01)。

血氨水平与脑细胞凋亡呈正相关。

3　讨论
肝硬化晚期发生慢性HE比较常见,近年来,许多学者发现慢性HE病人虽然常规的精神功能检查正常,但存在智力检测及脑诱发电位异常[2]。

病理显示慢性HE可出现大脑和小脑灰质以及皮质下星形胶质细胞增生和肥大,重者大脑皮质变薄,神经元和神经纤维消失,甚至皮质有点、片状坏死,慢性肝病长期伴高氨血症可促使这种病理学改变发生[3]。

在某些尸检中可见更明显的组织学损伤∃肝脑变性[4]。

一些HE病人的脑CT可见明显的大脑皮质萎缩,其超微结构显示血脑屏障的通透性增加[5]。

我们应用大鼠肝硬化动物模型发现:肝硬化大鼠存在血氨升高,给予氨负荷后[6],血氨水平更加显著升高,再一次证实了氨在HE发病中的作用[7]。

我们对大鼠的大脑皮层厚度进行检测,发现肝硬化组较正常组明显变薄,说明在肝硬化时,大鼠的大脑组织结构已经发生明显的改变。

为了进一步研究,我们检测了大鼠脑组织的细胞凋亡:正常情况下,大鼠脑组织也存在少量的细胞凋亡;肝硬化时大鼠脑组织凋亡细胞数明显增加,与正常对照组相比有显著性差异;同时,两组的血氨水平也存在明显差异,脑细胞凋亡数随着血氨的增高而逐渐增多,细胞凋亡与血氨水平呈正相关(r=0.69)。

肝性脑病的发病机理非常复杂,氨在其中是一个重要的致病因素,本实验不仅进一步证实氨是能够诱发HE的一个因素,而且发现氨可以促进脑细胞凋亡,它可能直接作用于脑神经细胞引起细胞凋亡,长期作用于脑组织可以导致大脑皮质变薄,这可能是肝性脑病发生意识障碍的病理基础。

【参考文献】
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brain levels of oxindole in experi m ental chr onic Hepatic Encepha2 l opathy:Effects of Syste m ic Ammonium Acetate and L2Tryp t ophan
[J].Phar macol Toxicol,1999;85:138-143.
[2]张丽华,崇雨田,庄鹏,等.血氨对亚临床肝性脑病的影响[J].
实用医学杂志,2003,19(4):376-377.
[3]漆德芳,孟申,刘健.肝硬化[M].北京:科学技术出版社,
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[4]梁扩寰,李绍白.肝脏病学[M].北京:人民卫生出版社,1995.
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[5]李晶,石理兰,刘沛.14C2缬氨酸在大鼠HE脑组织中的示踪观
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[6]渡边正義,尾崎孝幸,平田佳久.実験的肝性昏睡 ≤
における血中およぴ腦内 度ならびに昏睡に对する } (NS24)の作用[J].日薬理誌,1995,105:
97-109.
[7]刘洪艳,王静艳,雷薇,等.氨对肝硬化大鼠模型脑细胞凋亡的
影响[J].世界华人消化杂志,2004,12(8):1865-1867.
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