HPLC测定灵芝口服液中腺苷含量

灵芝作为中华九大仙草之一，是一种药用价值很高的真
菌[1-3]。

它提高免疫力、保护心血管系统、抗癌抗肿瘤的功效，促进活性成分的深入研究和开发，临床上的广泛使用[4-6]。

灵芝口服液是由灵芝提取物加工的主要产品之一，具有宁心安神、健脾
胃的作用，对失眠、健忘、疲劳乏力、困倦不振等病症有良好的疗效，临床上常用于治疗心脾两虚引起的神经衰弱[7]。

腺苷作为核酸的基本结构单位，是灵芝主要的有效成分之一，具有预防心律失常、改善血液循环、抑制神经递质释放等作用[8-10]。

本研究采用D-101型大孔树脂吸附纯化灵芝口服液中的腺苷，应用HPLC 法测定灵芝口服液中腺苷的含量，旨在探讨该法的应用价值，更
好地控制灵芝口服液的质量。

1仪器与试剂
TU-1901型双光束紫外分光光度计（北京普析通用有限公司）；LC-2010A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；超声波清洗器（无锡市美极超声波清洗机设备有限公司）。

腺苷标准品：中国药品生物制品检定所，纯度98%；灵芝口服液：湖南正清制药集团股份有限公司，国药准字Z20000010；纯化水，乙腈色谱纯，0.45μm微孔滤膜。

D-101型大孔树脂：药用级，南开大学化工厂；其他试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱：Diamonsi C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温为室温，流动相：乙腈-水（10∶90，V/V），进样量：10μL。

流速1.0mL/min，检测波长为260nm。

理论塔板数按腺苷峰计应不低于5000，阴性对照品无干扰。

2.2溶液制备
对照品溶液的制备：精密称取以P2O5为干燥剂减压干燥24h的腺苷对照品适量，使用0.01mol/L磷酸三钠溶液进行溶解，定容稀释至25mL容量瓶后摇匀；作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：精密量取20mL灵芝口服液，上柱洗脱。

具体操作见表1。

此外，阴性样品溶液按供试品溶液方法制备。

表1供试品溶液上柱洗脱程序
2.3方法学考察
线性关系考察：分别精密量取1，2，4，6，8mL对照品贮备液
置于25mL容量瓶中，加入0.01mol/L磷酸三钠溶液稀释至刻度
并摇匀。

分别精密吸取10μL上述溶液进样测定，测得的腺苷峰面积，分别以进样量（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标绘制标准曲线，经回归处理，获得回归方程Y=4021.10X-2.5589（r=
0.9996），显示腺苷浓度在2.143~105.6μg/mL范围内与峰面积呈现良好的线性关系。

精密度试验：按上述色谱条件，精密吸取10μL质量浓度52.8μg/mL的对照品溶液，连续进样5次。

测得的腺苷峰面积分别为2016.26，2025.72，2008.83，2013.27，2031.08，平均2019.30，RSD=0.79%，显示仪器精密度良好。

重复性试验：精密吸取10μL样品5份进行测定，按上述方法处理分析，得到腺苷含量分别为7.1248，7.1091，7.1318，7.1032，7.0876μg/mL，平均7.1203μg/mL，RSD=0.86%，表明此方法重现性良好。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液10μL，每隔2h进样1次，进样5次。

按上述方法测定，分别得到腺苷峰面积为1644.45，1639.67，1682.78，1652.64，1670.69，平均1660.77，RSD=1.27%，表明供试品溶液在8h内稳定性良好。

加样回收率试验：精密吸取10μL样品溶液（已知浓度7.1312pg/mL），分别加入1.0，1.5，2.0mL质量浓度47.8μg/mL的对照品溶液，平行操作2次，同样方法制备供试液并测定腺苷含量，计算回收率，结果见表2。

表2腺苷加样回收试验结果（n=6）
2.4样品含量测定：依拟定方法，取3批灵芝口服液样本制备供试品溶液，分别精密吸取10μL对照品溶液与供试品溶液各注入色谱仪，按上述色谱条件测定样本，按外标法以峰面积计算腺苷的含量。

灵芝口服液中腺苷的含量分别为7.3203，7.4108，7.3726μg/mL。

3讨论
3.1供试品溶液的制备：灵芝口服液中含有多种营养成分，如萜类、有机酸、有机碱、多肽和氨基酸，并含有大量的多糖、蛋白等干扰测定的成分，样品溶液黏度大，腺苷含量并不高，样本的除杂、浓集、纯化分离尤为重要[11]。

大孔吸附树脂、离子交换树脂、硅胶柱色谱和薄层色谱对灵芝菌丝体中的核苷类成分的分离均
供试品溶液上柱洗脱程序
A B C D 将样品加入预先处理好的D-101型大孔吸附树脂柱（1.5cm×11cm）50mL水洗脱，流速<0.5mL/min，弃洗脱液
100mL30%乙醇进行洗脱，收集洗脱液，水浴蒸干
0.01mol/L磷酸三钠溶液加入5mL容量瓶中并稀释至刻度，摇匀
HPLC测定灵芝口服液中腺苷含量
温正辉刘丽丹（嘉应学院医学院附属医院梅州514000）
摘要：目的：建立高效液相色谱（HPLC）法测定灵芝口服液中核苷成分腺苷的含量。

方法：采用HPLC法，腺苷吸附纯化：D-101型大孔树脂，色谱柱：Diamonsi C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温为室温，流动相：乙腈-水（10∶90，V/V），流速1.0mL/min，检测波长为260nm。

结果：腺苷质量浓度在2.143~105.6μg/mL（r=1.000）范围内与峰面积呈现良好的线性关系，RSD=1.04%（n=6），平均加样回收
率为98.39%。

结论：高效液相色谱法简单合理，准确可靠，可作为灵芝口服液中腺苷含量测定的分析方法，也为灵芝口服液的质量控制提供参考。

关键词：HPLC灵芝口服液腺苷含量测定
中图分类号：R286.0文献标识码：A文章编号：1672-8351（2019）05-0001-02
样品含量（μg）加入量
（μg）
测得量
（μg）
回收率
（%）
X（%）RSD（%）
0.1464 0.1464 0.1464 0.1464 0.1464 0.14640.1063
0.1063
0.1498
0.1498
0.1837
0.1837
0.2419
0.2428
0.2893
0.2876
0.3217
0.3201
98.25
98.51
98.38
98.02
98.48
98.31
98.39 1.04
·药品质量及检验·
红霉素软膏为白色至黄色软膏，为皮肤科用药类非处方药。

现行标准为《中国药典》2015年版二部，采用抗生素微生物检定法测定含量，操作烦琐费时，影响实验结果的因素较多，误差较大[1]。

国外药典现已采用HPLC法测定其含量，为更有效地控制本品质量，笔者参考了有关文献[2]建立了高效液相色谱法测定红霉素软膏的含量，结果表明该方法准确、简便。

1仪器与试药
岛津LC-2010C高效液相色谱仪，岛津UV-2550紫外分光光度计，梅特勒电子天平AE-240，红霉素标准品（中国食品药品检定研究院，批号：130307-201417、928U/mg、红霉素A组分：93.3%），红霉素软膏（新乡华青药业有限公司，批号：170301，160412，161102，规格：1%），乙腈为色谱纯，水为纯化水，其他试剂均为分析纯。

2方法与结果
2.1色谱条件：色谱柱为Agilent XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾8.7g，加水1000mL，用20%的磷酸调节pH值至8.2）-乙腈（40∶60）；流速1.0mL·min-1；检测波长为215nm；柱温：35℃；进样量：20μL。

2.2溶液的制备
2.2.1标准品溶液：精密称取红霉素标准品21.50mg，置200mL 量瓶中，加甲醇2mL（每10mg红霉素加甲醇1mL）使溶解，再加磷酸盐缓冲液（pH值7.0）-甲醇（15∶1）稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。

即得质量浓度为0.1003mg·mL-1的对照品溶液。

2.2.2供试品溶液：精密称取本品（约相当于红霉素约10mg）1.0025g，置分液漏斗中，加石油醚［选用沸程（60℃~90℃）］20mL，缓缓振摇，使基质溶解，用磷酸盐缓冲液（pH值7.8~8.0）提取4次，每次约25mL，合并提取液，置100mL量瓶中，加磷酸盐缓冲液（pH值7.8~8.0）稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为0.1002mg·mL-1的供试品溶液。

2.2.3阴性样品溶液：按红霉素软膏的处方比例（红霉素除外）制备空白样品，再按供试品溶液的制备方法制成阴性样品溶液。

2.3干扰试验：分别取“2.2.1”、“2.2.2”和“2.2.3”项下制备的溶液依次进样20μL，按上述色谱条件测定，记录色谱图，结果阴性样品无干扰，见图1。

HPLC法测定红霉素软膏的含量
刘玲周修森（信阳市食品药品检验所信阳464000）
摘要：目的：建立HPLC法测定红霉素软膏的含量。

方法：色谱柱为Agilent XDB-C18（4.6mm×250mm，5μm）；流动相为磷酸盐溶液（取磷酸氢二钾8.7g，加水1000mL，用20%的磷酸调节pH值至8.2）-乙腈（40∶60）；流速1.0mL·min-1；检测波长为215nm。

结果：红霉素在2.467~79.340μg·mL-1浓度范围内线性关系良好，r=0.9999，平均回收率为99.82%，RSD为0.4%（n=9）。

结论：此法简单可行，准确可靠，可用于红霉素软膏的含量测定。

关键词：红霉素软膏红霉素HPLC
中图分类号：R927.2文献标识码：A文章编号：1672-8351（2019）05-0002-02
有研究报道[12]。

而本研究采用大孔吸附树脂除去大量水溶性杂质，并分析大孔吸附树脂柱乙醇洗脱液的效果，结果显示随着乙
醇浓度的升高，洗脱液颜色加深，除前100mL30%乙醇洗脱液
外，其余均不含待测成分。

以上结果表明增加洗脱乙醇的浓度
也会导致测定溶液中杂质增加，故以30%乙醇洗脱为好。

3.2流动相的选择：本研究比较磷酸二氢钾溶液-甲醇、甲醇-水、乙腈-水等多种流动相系统，发现差异并不明显。

选择以乙
腈-水为流动相，并对其不同比例反复进行试验，最后确定为10∶90，采用该比例，出峰快且峰型较好。

在实验过程中，严格控制色谱条件，才能达到理想的分离效果，制定量化的指标是控制灵芝口服液内在质量和保证其临床疗效的有效途径[13]。

3.3波长的选择：将腺苷对照品适量，加0.01mol/L磷酸三钠（Na3PO4.12H2O）溶液制成25pg/mL对照品溶液，置于紫外分光光度计中检测，记录紫外吸收光谱，在260nm波长处有最大吸收，故选择260nm为测定波长。

综上所述，本文采用高效液相色谱法（HPLC）测定灵芝口服
液中腺苷的含量具有较多优势。

该方法不但操作简便科学、而
且专一性强，精密度、稳定性及准确度高，分析时间短，可作为腺
苷定量分析的评价指标，为灵芝口服液质量控制、进一步研究和
开发灵芝产品提供参考。

参考文献
[1]周彦娜，薄世兴，陈莹，等.复方灵芝口服液对睡眠剥夺大鼠睡眠的影响[J].中国食物与营养，2015，21（9）：70-72. [2]卢端萍，蒋婷婷，陈硕，等.高效液相色谱法测定灵芝提取物中尿苷和腺苷含量[J].中国药业，2013，22（14）：17-19. [3]席桂同.高效液相色谱法测定灵芝提取物中尿苷和腺苷含量[J].世界中医药，2014，9（7）：934-937.
[4]周泽伟，李楠，余峥嵘，等.黄芪灵芝口服液对免疫新城疫疫苗雏鸡免疫功能的影响[J].中国畜牧兽医，2015，42（7）：1859-1864.
[5]金文闻，陈雪敏，杨飘，等.国产玛咖中腺苷含量的高效液相色谱分析[J].食品科学，2016，37（12）：148-149，151.
[6]袁蜜，乐昕，徐鲁荣，等.高效液相色谱法同时测定蛹虫草子实体中腺苷和虫草素含量[J].食品科学，2013，34（13）：304-310. [7]施新琴，顾寅钰，郭光，等.蚕蛹虫草中虫草素和腺苷含量影响因素研究[J].山东农业科学，2015，47（1）：109-111.
[8]姜翠翠，高家荣，储昭兴，等.RP-HPLC法测定地黄及其复方制剂中尿苷和腺苷的含量[J].安徽医药，2013，17（9）：1493-1495.
[9]李兵，张文成，王冰嵩，等.HPLC法同步测定蛹虫草中虫草素及腺苷的含量[J].安徽化工，2016，42（4）：105-107. [10]岳显可，曹岗，吴瑶，等.HPLC法测定猴头菇核苷类成分腺苷的含量[J].实用药物与临床，2015，18（4）：432-436. [11]黄力君.HPLC法测定虫草中腺苷的含量[J].江西中医药，2016，47（9）：75-76.
[12]郑琴，胡鹏翼，龚莹莹，等.HPLC法测定不同产地山药饮片中尿囊素和腺苷的含量[J].江西中医学院学报，2013，25（3）：32-35.
[13]沈萍，汪军，李忠贵，等.HPLC测定大豆磷脂虫草头孢菌粉溶液中腺苷的含量[J].江西中医药大学学报，2016，28（2）：65-67.。