盐酸克伦特罗对小鼠肾脏抗氧化能力的影响

盐酸克伦特罗对小鼠肾脏抗氧化能力的影响
王昱
【摘要】研究盐酸克伦特罗对小鼠肾脏抗氧化能力的影响.选健康小鼠,每日以不同剂量的盐酸克伦特罗灌胃,连续用药30 d.用比色法检测用药5,10,20,30 d后小鼠肾脏超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP)的活性和丙二醛(MDA)含量的变化.结果表明,与对照组比较,盐酸克伦特罗可使小鼠肾脏SOD,CAT,AKP,ACP活性降低,MDA含量升高,具有时间-剂量效应；双因素方差分析表明,剂量因素对结果的影响大于时间因素.盐酸克伦特罗可破坏小鼠肾脏氧化与抗氧化的动态平衡,造成肾脏损伤.%To study effects of clenbuterol hydrochloride on antioxidant capacity in the kidney of mice, healthy mice were chosen dealing with daily intragastric administration with different dose of clenbuterol for 30 days. Colorimetry was used to detect the activities of superoxide dismutase, catalase, alkaline phosphatase, acid phosphatase and the malondialdehyde content at 5, 10, 20 and 30 days. Compared with the control group,the level of SOD, CAT, ACP and AKP tended to be reduced, while the level of MDA seemed to be elevated. The degree of the changes was in dose and time-dependent effect. Results of Two-Way ANOVA indicated that dose contributed more to clenbuterol-induced kidney damage than treatment time. Clenbuterol could destroy the balance between oxidative stress and anti-oxidative function of mice's kidney, which could result in kidney injury.
【期刊名称】《宁夏大学学报（自然科学版）》
【年(卷),期】2012(033)001
【总页数】5页(P79-83)
【关键词】盐酸克伦特罗;肾脏;抗氧化能力;比色法;小鼠
【作者】王昱
【作者单位】陇南师范高等专科学校生物系,甘肃成县742500
【正文语种】中文
【中图分类】Q952.5
盐酸克伦特罗，又名瘦肉精，化学名为α－［（叔丁氨基）甲基］－4－氨基－3，5－二氯苯甲醇盐酸盐，是一种从天然儿茶酚胺衍生合成的化合物.盐酸克伦特罗既不是兽药，也不属于饲料添加剂，是一种名副其实的激素类物质，在动物体内吸收快、分布广、脂溶性高，具有残留性积蓄及半衰期长等药理特性，长期使用后，极易在动物性产品中产生蓄积［1］，残留最高的组织是肺，其次是肝和肾［2］.若
过量食入，可促使血压升高、血管扩张、心率加快、呼吸加剧、体温上升、心脏和肾脏负担加重等，并出现采食量下降、行为动作失调、神经紧张不安甚至全身振颤反应，并极大地影响蛋白质代谢、脂肪代谢及肝脏中的糖代谢，严重影响动物正常的生长发育［3—5］.目前，有关盐酸克伦特罗影响的研究主要集中在心、肝、免疫、生殖等器官.邹本革等［6］报道了盐酸克伦特罗对小鼠心肌ATP酶和抗氧化
能力的影响；王恩峰等［7］研究了盐酸克伦特罗对小鼠体重及心脏组织形态学的影响；聂木海等［8］研究了盐酸克伦特罗对大鼠免疫器官的影响；李明祯等［9］研究了盐酸克伦特罗对小鼠肝脏的损伤；张园园等［10］还做了关于盐酸克伦特
罗对生殖内分泌毒性的研究.笔者用盐酸克伦特罗灌胃方式给小鼠染毒，观察并检
测发育期小鼠肾脏超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（acid phosphatase， ACP）活性及丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，从而探讨盐酸克伦特罗对生长发育期小鼠肾脏的毒性及其可能的作用机制，可为临床盐酸克伦特罗中毒的防治提供参考.
1 材料与方法
1.1 试剂及仪器
盐酸克伦特罗（白色结晶性粉末，安徽淮南山河药用辅料有限公司）.根据半数致
死剂量将盐酸克伦特罗设12.5，25.0，50.0mg／kg（体重）3个剂量组
［5］.SOD，CAT，AKP，ACP，MDA检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）. U－1800UV－VIS spectrophotometer全自动分光光度计（日本Tokyo公司）；TGL－16M高速台式冷冻离心机（美国Beckman公司）.
1.2 实验动物与给药
选刚断奶昆明小鼠160只（兰州大学实验动物中心），雌雄各80只，体重m＝18～20g，随机分为4组（对照组和3个实验组），每组40只.实验组分别用
l2.5（Ⅰ），25.0（Ⅱ），50.0（Ⅲ）mg／kg（体重）的盐酸克伦特罗灌胃，每
天灌胃2次（9：00，16：00），每次给药量为0.5mL／10g（体重），连续给
药30d.对照组每天以等量生理盐水灌胃.
1.3 酶活性测定
分别取给药5，10，20，30d的小鼠肾脏，在预冷的生理盐水中漂洗，滤纸吸干，精确称重；滴加9倍肾脏组织质量的生理盐水，置入匀浆器中在冰水中匀浆
（5min），再3 000r／min离心10min；用微量移液器吸取上层清液，按试剂盒的操作要求用全自动分光光度计分别测定SOD，CAT，AKP，ACP的活性及
MDA的含量.
1.4 数据处理
用SPSS 13.0软件进行统计学分析处理，数据用¯x±s表示，实验组与对照组间平均数比较用双尾t检验；剂量、时间及剂量与时间的交互作用对小鼠肾脏抗氧化能力的影响采用双因素方差进行分析比较（P＜0.05表示显著差异，P＜0.01表示差异极显著）.
2 结果
2.1 SOD活性的变化
盐酸克伦特罗影响生长发育中小鼠肾脏中SOD的活性（表1）.由表1可知，盐酸克伦特罗灌胃后，各发育期肾脏SOD的活性均有不同程度的降低.Ⅰ实验组，在
5d时小鼠肾脏SOD的活性略低于对照组（P＞0.05），在10～30d时显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；Ⅱ，Ⅲ实验组，在5～30d时SOD的活性低于对照组，差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）.
双因素方差分析结果见表2.由表2可知，剂量因素对小鼠肾脏SOD活性的影响极显著，时间因素对小鼠肾脏SOD活性的影响显著，而且两因素间的交互作用极显著.剂量因素对小鼠肾脏SOD活性的影响远大于时间因素.
2.2 CAT活性的变化
盐酸克伦特罗影响生长发育中小鼠肾脏中CAT的活性（表3）.Ⅰ实验组，在5～10d时CAT的活性与对照组相比差异不显著（P＞0.05），在20～30d时CAT
的活性显著下降，与对照组差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）；Ⅱ，Ⅲ实
验组，在5～30d时CAT的活性低于对照组，差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）.
双因素方差分析结果见表4.由表4可知，剂量和时间因素对小鼠肾脏CAT活性的影响极显著，而且两因素间的交互作用极显著.剂量因素对小鼠肾脏CAT活性的影
响大于时间因素.
表1 盐酸克伦特罗灌胃后小鼠肾脏SOD活性的变化（¯x±s）注：与对照组比较，＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.实验组 Zm／（U·mg－1）5d 10d 20d 30d对照组122.21±8.13 134.15±10.72 146.01±10.62 158.50±11.58Ⅰ119.24±3.66 123.07±9.94＊131.22±11.14＊＊143.32±12.50＊＊Ⅱ108.48±2.29＊111.19±2.08＊＊120.90±3.21＊＊134.08±4.57＊＊Ⅲ87.56±1.99＊＊
96.84±4.01＊＊105.28±2.07＊＊117.65±3.17＊＊
表2 剂量、时间对小鼠肾脏SOD活性的影响注：＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.变异源平均方差自由度统计量η2 0.896时间 1 788.849 3 55.713＊ 0.366剂量×时间 2 272.432 9 15.332＊＊ 0.705误差 111.278 55剂量 62 106.220 5 410.31＊＊——
表3 盐酸克伦特罗灌胃后小鼠肾脏CAT活性的变化（¯x±s）注：与对照组比较，＊P为＜0.05，＊＊为P＜0.01.实验组 Zm／（U·mg－1）5d 10d 20d 30d对照组152.50±3.08 163.27±9.20 182.28±7.23 190.77±10.14Ⅰ149.45±2.51 160.50±5.03 169.55±2.84＊ 175.56±5.53＊＊Ⅱ133.14±6.31＊145.66±6.02＊＊157.28±2.22＊＊162.37±7.05＊＊Ⅲ128.12±4.01＊＊133.42±4.27＊＊145.54±7.06＊＊158.77±6.82＊＊
表4 剂量、时间对小鼠肾脏CAT活性的影响注：＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.变异源平均方差自由度统计量η2 0.924时间 3 721.652 3 48.833＊＊ 0.471剂量×时间 5 550.484 9 62.507＊＊ 0.889误差 88.571 55剂量 25 543.176 5 136.50＊＊——
2.3 ACP活性的变化
盐酸克伦特罗影响生长发育中小鼠肾脏中ACP的活性（表5）.由表5可知，盐酸克伦特罗灌胃后，各发育期肾脏ACP的活性均有不同程度的降低.Ⅰ实验组，在
5d时小鼠肾脏ACP的活性略低于对照组（P＞0.05），在10～30d时显著降低（P＜0.05，P＜0.01）；Ⅱ，Ⅲ实验组，在5～30d时ACP的活性低于对照组，差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）.
双因素方差分析结果见表6.由表6可知，剂量因素对小鼠肾脏ACP活性的影响极显著，时间因素对小鼠肾脏ACP活性的影响显著，而且两因素间的交互作用极显著.剂量因素对小鼠肾脏ACP活性的影响远大于时间因素.
2.4 AKP活性的变化
盐酸克伦特罗影响生长发育中小鼠肾脏中AKP的活性（表7）.由表7可知，盐酸克伦特罗灌胃后，各发育期肾脏AKP的活性均有不同程度的降低.Ⅰ实验组，在5～10d时小鼠肾脏AKP的活性略低于对照组（P＞0.05），在20～30d时显著降低（P＜0.05）；Ⅱ，Ⅲ实验组，在5～30d时AKP的活性低于对照组，差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）.
双因素方差分析结果见表8.由表8可知，剂量和时间因素对小鼠肾脏AKP活性的影响极显著，而且两因素间的交互作用显著.剂量因素对小鼠肾脏AKP活性的影响大于时间因素.
2.5 MDA含量的变化
盐酸克伦特罗影响生长发育中小鼠肾脏中MDA的含量（表9）.由表9可知，盐酸克伦特罗灌胃后，各发育期肾脏MDA的含量均有不同程度的升高.Ⅰ实验组，在5d时小鼠肾脏MDA的含量略高于对照组（P＞0.05），在10～30d时显著升高（P＜0.05，P＜0.01）；Ⅱ，Ⅲ实验组，在5～30d时MDA的含量高于对照组，差异显著或极显著（P＜0.05，P＜0.01）.
双因素方差分析结果见表10.由表10可知，剂量和时间因素对小鼠肾脏MDA含量的影响极显著，而且两因素间的交互作用极显著.剂量因素对小鼠肾脏MDA含量的影响大于时间因素.
表5 盐酸克伦特罗灌胃后小鼠肾脏ACP活性的变化（¯x±s）注：与对照组比较，＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.实验组 Zm／（U·mg－1）5d 10d 20d 30d对照组44.22±1.31 53.17±2.04 58.38±3.33 66.03±2.82 41.56±1.45 45.08±1.90＊49.35±2.04＊52.82±3.41＊＊Ⅱ33.05±1.19＊39.76±1.52＊＊45.12±1.43＊＊51.56±2.25＊＊Ⅲ27.21±1.44＊＊33.47±1.05＊＊38.57±2.40＊＊
47.79±1.17Ⅰ＊＊
表6 剂量、时间对小鼠肾脏ACP活性的影响注：＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.变异源平均方差自由度统计量η2 0.903时间 531.820 3 32.639＊ 0.226剂量×时间 827.132 9 15.259＊＊ 0.671误差 62.785 55剂量 2 164.246 5 230.62＊＊——
表7 盐酸克伦特罗灌胃后小鼠肾脏AKP活性的变化（¯x±s）注：与对照组比较，＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.实验组 Zm／（U·mg－1）5d 10d 20d 30d对照组18.26±1.41 20.12±1.04 25.33±1.33 30.83±2.28 16.87±1.05 18.48±1.10
19.25±1.42＊24.91±1.31＊Ⅱ14.55±1.10＊15.76±1.25＊＊17.77±1.34＊＊
20.36±2.45＊＊Ⅲ11.12±1.40＊＊13.74±1.65＊＊16.54±2.17＊＊
17.88±1.33Ⅰ＊＊
表8 剂量、时间对小鼠肾脏AKP活性的影响注：＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.变异源平均方差自由度统计量η2 0.927时间 531.820 3 32.639＊＊ 0.625剂
量×时间 827.132 9 15.259＊ 0.443误差 62.785 55剂量 1 162.486 5 230.62＊＊——
表9 盐酸克伦特罗灌胃后小鼠肾脏MDA含量的变化（¯x±s）注：与对照组比较，＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.实验组 w／（nmol·mg－1）5d 10d 20d 30d对照组10.42±0.27 10.88±0.44 10.71±0.38 10.96±0.55Ⅰ10.74±0.31
11.55±0.22＊11.97±0.15＊12.78±0.61＊＊Ⅱ11.11±0.34＊12.83±0.42＊＊
13.47±0.50＊＊15.34±0.25＊＊Ⅲ13.22±0.27＊＊15.02±0.44＊＊
16.61±1.04＊＊ 18.37±0.56＊＊
表10 剂量、时间对小鼠肾脏MDA含量的影响注：＊为P＜0.05，＊＊为P＜0.01.变异源平均方差自由度统计量η2 0.940时间 551.182 3 34.774＊＊
0.377剂量×时间 774.153 9 14.227＊＊ 0.822误差 38.619 55剂量 1 445.335 5 154.82＊＊——
3 讨论
盐酸克伦特罗滥用已成为严重的社会问题.少年儿童的组织器官正处于快速发育和完善时期，接触有毒物品特别容易引发过量的自由基反应，从而造成DNA损伤、细胞凋亡等［11］，使SOD，CAT，AKP，ACP合成量减少或酶失活，使MDA 的含量增加.因此，通过检测肾脏SOD，CAT，AKP，ACP活性和MDA含量的变化，可以反应肾脏过氧化损伤的情况.
SOD是动物机体内广泛存在的重要的过氧化物分解酶，能够催化超氧化物阴离子自由基（O－2）发生歧化反应，将其转变为H2O2和O2；SOD是生物重要的保护酶，其活性的高低间接反映了动物机体清除自由基的能力［12］.在正常生理条件下，机体内自由基不断生成，又不断被清除，生成与清除维持相对的动态平衡，因而从整体上看显示不出自由基对机体的氧化损伤或生理破坏作用.如过多的自由基超出机体的清除能力，体内自由基产生与清除之间的动态平衡受到破坏，可发生由过多自由基引起的一系列对机体有害的生理、病理改变［6］.该实验表明，12.5（Ⅰ），25.0（Ⅱ），50.0（Ⅲ）mg／kg（体重）3个剂量组中小鼠肾脏SOD 的活性呈降低趋势.说明盐酸克伦特罗灌胃后，体内自由基产生与清除之间的动态平衡遭到破坏，过量的自由基攻击细胞，超出机体的清除能力，从而使SOD活性降低.随着盐酸克伦特罗的浓度逐渐升高，灌胃时间累积延长，对小鼠肾脏SOD活性的作用明显，即对SOD防御系统的损害越严重.在以往的报道中，盐酸克伦特罗
使小鼠肝脏SOD和GSH－PX的活性显著下降［9］，使大鼠血清中SOD活性也显著降低［8］.
羟自由基（OH·）是化学性质非常活泼的另一种活性氧，它的大量积累会导致机体的过氧化损害.CAT能够清除SOD催化活性氧自由基所产生的H2O2，使其转化
为H2O和O2，减轻生物体受到的伤害；但是过量的无法清除的自由基长时间攻
击细胞致使抗氧化系统被破坏，SOD活性下降，氧化修饰CAT的氨基酸残基，破坏CAT的结构，降低与底物结合的能力，最终也导致CAT活性降低［13—14］.该实验中，盐酸克伦特罗灌胃后，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ3个剂量组中小鼠肾脏CAT的活性
均有不同程度的降低，可能就是这个原因.说明小鼠肾脏CAT活性与盐酸克伦特罗之间具有时间－剂量效应，即盐酸克伦特罗的浓度越高，而且累积时间越长，对的小鼠肾脏CAT活性的影响程度越大.
磷酸酶又称磷酸单酯水解酶，广泛存在于生物体内的各种组织细胞中，是生物体内的重要代谢调控酶，也是细胞内溶酶体的标志酶，根据它们催化作用的最适pH特性，可分为AKP和ACP.AKP和ACP在蛋白酶的去磷酸化过程中起着十分重要的作用，它们不仅参与一些营养物质的消化、吸收、运输，而且还是生物体内重要的解毒体系，其活性的高低反映细胞吞噬消化功能的强弱［15—16］.该实验研究表明，盐酸克伦特罗灌胃后，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ3个剂量组中小鼠肾脏AKP和ACP的活性都有所下降，这表明盐酸克伦特罗可能诱发并引起了机体氧化损伤或生理破坏作用，导致肾脏细胞损伤，进而引起AKP和ACP活性降低.从表5，7可以看出，各实验组随着灌胃时间的持续，小鼠肾脏AKP和ACP活性与对照组的差异越显著，而且随着盐酸克伦特罗浓度的升高，小鼠肾脏AKP和ACP活性的降低幅度越大，说明盐酸克伦特罗对小鼠肾脏AKP和ACP活性的影响具有时间－剂量效应关系.
活性氧最易攻击细胞膜上的不饱和脂肪酸，产生过氧化作用，其分解产物MDA可造成DNA分子链断裂或碱基缺失，同时又可与蛋白质的游离氨基作用，引起蛋白
质分子内和分子间交联［17］，使膜的流动性和弹性下降，可直接破坏细胞膜结
构的完整性［6］.所以，MDA的含量可以反映脂质过氧化物的生成量，据此可以
推断机体内的脂质过氧化损伤情况；MDA的含量还可以反映自由基的产生和抗氧化系统的功能状况，并作为机体氧化胁迫的指示［18］.李明祯等［9］在研究盐酸克伦特罗对小鼠肝脏的损伤时发现，小鼠肝中MDA的含量显著升高［8］.该实验结果显示，盐酸克伦特罗灌胃后，Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ3个剂量组中小鼠肾脏MDA的含量都呈升高趋势，表明机体摄入大量盐酸克伦特罗后破坏了机体抗氧化酶机制，抗氧化酶活性下降，细胞被无法清除的过量自由基攻击，大量脂质过氧化物降解，导致MDA含量增加.
盐酸克伦特罗在小鼠毛发、肝肾和肌肉中的残留量与累积时间呈正向关系［19］，对小鼠心肝、大鼠血清抗氧化能力的影响具有明显的剂量效应关系［6—9］.该实
验表明，盐酸克伦特罗影响了肾脏SOD，CAT，AKP，ACP活性和MDA的含量，而且剂量因素对小鼠肾脏SOD，CAT，AKP，ACP活性和MDA含量的影响大于
时间因素.这可能是处于生长发育期小鼠的肾脏对盐酸克伦特罗很敏感，容易通过
肾小体滤过膜，进而引起SOD，CAT，AKP，ACP活性及MDA含量的改变，最
终造成肾脏损害.
综上所述，盐酸克伦特罗对小鼠肾脏发育的影响具有时间－剂量效应，会引起小鼠肾脏抗氧化能力的下降.但盐酸克伦特罗是怎样导致抗氧化能力降低的具体机制，
还需要更进一步的研究.
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