应用原态提取法提取食药用菌活性物质的抗衰老功效研究

应用原态提取法提取食药用菌活性物质的抗衰老功效研究
通过研究不同剂量的2种食用菌原态提取物对果蝇寿命的影响，初步确定适宜给药剂量为20 g/L；比较了原态提取法和传统热水浸提法提取物的抗衰老功效，结果表明，3种食用菌的原态提取物均较相应的热水提取物具有明显优势；对22种食用菌子实体和1种食用菌加工产品的原态提取物进行了果蝇生存试验，从中筛选出茶树菇、栎金钱菌等7种有显著抗衰老功效的品种，同时发现部分试验品种提取物的抗衰老功效具有明显性别差异。

食药用菌；抗衰老；原态提取法；活性提取物
S567.301;R151.3A
灵芝、茯苓、冬虫夏草等食药用菌在我国古代就被用作养生调理、扶正固本、化痰润肺、延年益寿和对抗年老体衰的药材[1]。

现代研究表明，灵芝、银耳、茯苓和木耳等品种的多糖、多肽和萜烯类物质具有抑制肿瘤、免疫调节、降糖降脂和抗氧化等功效[2，3]，食药用菌类中药在防治老年病和抗衰老方面有着广泛的药理学基础[4]，采用现代实验技术从食药用菌中寻找抗衰老药源的前景广阔。

食药用菌（通常指食药用菌子实体）中含有的生物活性物质包括水溶性的多糖、生物碱盐、黄酮等，醇溶性的油脂、甾醇等，脂溶性的萜类、游离生物碱、甙类等。

常规的提取方法如煎煮法和浸渍法都存在不少问题：首先，得到的提取液成分单一，只提取了部分活性物质，造成其他有效成分的流失；其次，各成分间在高温提取条件下容易发生络合、水解、氧化还原等化学反应，使原始成分发生改变；再次，常温下以水为溶剂提取时，提取液容易发生酶解和因微生物增殖而变质；此外，石油醚和乙醇等有机溶剂在较高温度下易挥发，甚至有发生燃烧的危险。

针对上述提取方法的缺陷，我们研制了食用菌活性物质的原态提取方法（专利申请号200610123109.X），整个过程均在20 ℃以下的较低温度条件下进行，基本控制了水解、酶解等化学反应，抑制了微生物的繁殖，避免了有机溶剂的挥发；针对低温下溶解率降低的缺陷，本方法采取了超声波促溶的措施；根据醚与醇、醇与水之间的相溶性，以及醚、醇对微生物的抑杀作用特点，采用从醚提到醇提再到水提的次序进行连续的提取操作，缩短了提取时间，基本保持了食用菌中活性物质的原始结构状态，维持了其天然药理作用。

本试验结合果蝇生存试验模型，研究了茶薪菇、灵芝等22种食药用菌子实体和1种食药用菌加工产品（全灵芝剥壁孢子粉，专利授权号ZL99117256.6）原态提取物的抗衰老功效，筛选有显著抗衰老功效的提取物。

1 材料与方法
1.1试验材料
试验材料及其来源参见表1。

1.2实验动物和培养基
实验动物为野生型纯种黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）,由华南师范大学生命科学学院提供。

果蝇基础培养基：红糖13.5%，玉米粉10%，琼脂1.5%，干酵母1%，苯甲酸0.15%，水73.85%。

a:子实体由广东省微生物研究所驯化栽培获得，b:子实体购自广州市一德路干货市场，c:以下简称“全灵芝”,由广东粤微食用菌技术有限公司提供a: Fruit bodies obtained from the Guangdong Institute of Microbiology, b: Fruit bodies obtained from Guangzhou Yide Road Dried Food Markets, c: Provided by Guangdong Yuewei Edible Fungi Technology Co. Ltd
1.3试验方法
1.3.1活性物质提取方法
1.3.1.1原态提取法
称取食药用菌原料各2 kg，进行活性物质原态提取，具体工艺流程如图1。

原料低温脱水：根据品种的不同,采用-25～-30 ℃冷冻温度和30～80 Pa负压的方法将新鲜的食用菌原料脱水干燥。

冷却粉碎：采用水冷式粉碎机(WZL400型,济南倍力粉技术工程有限公司)20 ℃以下粉碎食
用菌原料(过20目筛）。

低温脂提：以石油醚（分析纯,沸程60～90 ℃）为溶剂，溶剂体积用量为食用菌体积2～5倍，在20 ℃温度下浸提粉碎食用菌原料浸提1～4 h，同时加超声波震荡处理，用定性滤纸抽滤。

重复浸提滤渣1～2次，合并滤液，将滤渣稍阴干。

低温醇提：以乙醇（95%，分析纯）为溶剂浸提，利用乙醇与醚提溶剂的相溶性，醇提可不必等脂提滤渣干透便可进行。

其他步骤与脂提相同。

低温水提：以0～10 ℃纯水为溶剂，利用乙醇与水的相溶性，可不必等醇提滤渣干透便可进行水提。

其他步骤与脂提相同。

滤渣可丢弃。

超滤分离：采用耐受有机溶剂的超滤装置（广东环凯微生物科技有限公司组
装），将提取的滤液中分子量小于6000和大于200万道尔顿的成分去除，得浓缩液。

冷冻干燥：采用冷冻干燥机(FZ 122, LABCONCO公司,美国)-65 ℃将分离出的浓缩液干燥后，暂存于干燥皿。

低温混合：采用家用绞碎机将3种浸提产物在20 ℃下搅拌混合，得原态提取物。

冷冻保藏：将原态提取物装于玻璃或塑料容器内充氮密封，-15 ℃以下保藏。

1.3.1.2热水浸提法
2 kg供试食用菌子实体常温下粉碎后根据质地不同加入适量（比浸没子实体粗粉的量多1倍）的清水，充分浸润1～2 h，然后沸腾煎煮1～2 h，粗滤后料渣再重复以上步骤2～3次，然后将所有滤液静置片刻后过滤，再经50 ℃烘干得提取物。

1.3.2给药剂量筛选试验
以果蝇基础培养基为对照组，茶树菇和木耳原态提取物均设3个给药组，低剂量给药组（果蝇基础培养基+5 g/L提取物）、中剂量给药组（果蝇基础培养基+20 g/L提取物）和高剂量给药组（果蝇基础培养基+80 g/L提取物），进行果蝇生存试验，筛选适宜给药剂量。

取羽化10 h内的黑腹果蝇，用短时冷冻麻醉法将雌雄分开，避免繁殖，分装在装有上述4种培养基的指管中（20只/管），指管置于透光培养箱，25 ℃恒温培养，相对湿度保持在50%～70%，每4 d更换新鲜配制的培养基，每天定时统计果蝇死亡数，雌、雄果蝇各5次重复。

分析添加了2种提取物的培养基对果蝇寿命的影响。

寿命延长率（%）=(给药组果蝇平均寿命-对照组果蝇平均寿命)/对照组果蝇平均寿命×100。

1.3.3提取方法对比试验
采用原态提取法和热水浸提法提取全灵芝、云芝、香菇的活性物质，并对每种食用菌的不同提取物进行活性物质得率和果蝇寿命延长率比较。

活性物质得率计算公式：活性物质得率（%）=（活性提取物重量/原料重量）×100。

通过进行果蝇生存试验计算果蝇寿命延长率,果蝇基础培养基分别添加试验筛选最佳剂量浓度的活性提取物，分装到指管中，果蝇生存试验具体操作同
1.3.2。

1.3.4原态提取物抗衰老活性筛选试验
采用原态提取法提取23种供试食药用菌的活性物质，进行果蝇生存试验，具体实验操作同 1.3.2。

分析添加了各种提取物的培养基对果蝇寿命的影响，初步筛选出有抗衰老效果的食药用菌品种。

2 结果与分析
2.1给药剂量试验结果
给药剂量筛选试验结果表明，当茶树菇活性提取物添加量为中剂量20 g/L 时，雌、雄果蝇的平均寿命均较其他剂量组的长，寿命延长率雄性达43.2%，雌性达20.3%(图2)；木耳活性提取物添加量为20 g/L时，雌性果蝇的寿命显著长于其他两剂量组，寿命延长率达19.12%，雄性果蝇的寿命延长率为27.8%，略低于5 g/L低剂量组的29.7%，二者间差异不明显，但显著高于80 g/L高剂量组(图3)。

综合考虑2种提取物对雌、雄果蝇寿命的影响，认为20 g/L为合适的给药剂量。

在3个试验剂量下，2种提取物对果蝇的延寿作用具有明显的性别差异，对雄性的效果好于对雌性。

2.2提取方法对比试验结果
由表2可见，采用原态提取法提取全灵芝、云芝和香菇活性物质，其活性物质得率和对果蝇寿命延长率均明显比热水浸提法高，其中云芝的原态提取物比热水浸提物对果蝇寿命延长率提高接近2倍。

2.3原态提取物活性筛选试验结果
图4为23种食药用菌品种原态提取物对雌雄果蝇寿命的影响情况，结果表明，木耳、云芝、全灵芝、茶树菇、黄拟口蘑、栎金钱菌和松茸7个品种的原态提取物对雌雄果蝇寿命均有延长作用，对雄性果蝇寿命的平均延长率均高于27.80%，好于对雌性果蝇，其中以栎金钱菌的延长寿命效果最佳，对雌、雄果蝇寿命的延长率分别达48.4%和58.0%，而全灵芝提取物对雄性果蝇寿命的延长率比雌性果蝇高11.2倍，茶树菇提取物对雄性果蝇寿命的延长率比雌性果蝇高1.1倍，其余5种提取物对雌、雄果蝇寿命的延长率差距相对较小。

姬松茸、蛹虫草、大盖小皮伞、银耳、香菇、木蹄层孔菌的原态提取物对雄性果蝇寿命有延长作用，对雌性果蝇寿命反而有缩短
作用；毛蜂窝菌、杏鲍菇、褐顶环柄菇的原态提取物对雌性果蝇寿命有延长作用，而对雄性果蝇寿命有缩短作用；金黄枝瑚菌、赤芝、紫芝、猴头菇、毛木耳、革耳、灰树花的原态提取物对雌、雄果蝇的寿命影响均为缩短作用。

3 讨论
3.1食药用菌原态提取物的抗衰老动物试验效果与饲料中提取物的添加浓度表现出明显的相关性，存在最适浓度，浓度过大抗衰老效果反而下降，可能是食药用菌中同时存在有利和不利于动物机体甚至表现毒性的成分，部分品种的负性效果有可能源于此类物质对果蝇的毒性，提示食药用菌产品尤其是经过浓缩的深加工产品不应过量服食，今后应加强最佳服食剂量方面的研究。

3.2本实验中原态提取法在活性物质得率和抗衰老阳性率等方面明显优于传统的热水浸提法，提示食药用菌中的抗衰老活性成分非单一的组分，并可能存在协同作用。

但由于该方法的提取物成分较复杂，今后还应进一步细化研究其组分类群和作用机理。

希望我们的试验研究能够为加快开发食药用菌资源宝库提供一点点启示。

参考文献
[1] 林志彬主编.灵芝的现代研究（第二版）[M].北京：北京医科大学出版社，2001: 70-72.
[2] YEN GC, WU JY. Antioxidant and radical scavenging properties of extracts from Ganderma tsugae[J]. Food Chemistry, 1999, 65(3): 375-379.
[3] 辛晓林，黄清荣，卜庆梅. 真菌多糖延缓衰老药理研究进展[J]. 中国食用菌, 2000, 19（增刊）: 186-216.
[4] 李昌煜, 何煜舟. 真菌类中药防治老年病和抗衰老的作用探要[J]. 传统中药函授杂志, 1998, 17（5）: 50-52.
于荣利。