SOX9在比格犬腭中缝磁力牵张成骨过程中表达变化的研究

SOX9在比格犬腭中缝磁力牵张成骨过程中表达变化的研究童菲;欧阳志强;郭俊;黄维
【摘要】目的通过比较应用磁力与机械力扩弓后,比格犬上颌腭中缝骨组织中SOX9基因的表达,探讨磁力对上颌腭中缝骨组织改建的影响.方法将18只雄性6月龄比格犬按扩弓力源随机平均分为磁力组、机械力组和空白组,分别佩戴磁力扩弓矫治器和螺旋机械扩弓矫治器,空白组比格犬不佩戴任何矫治器.磁力组每周加载1次,每次扩弓器扩开量为1.5mm,机械力组每周加载两次,每次将螺旋扩弓器扩开3/4圈(0.75mm).连续加力5周后,处死所有比格犬,取其上颌腭中缝骨组织.应用RT-PCR法检测SOX9基因的表达差异.结果 RT-PCR结果显示,机械力组和磁力组比格犬的腭中缝组织中SOX9 mRNA表达水平显著高于对照组,且磁力组的SOX9 mRNA的表达量多于机械力组.结论磁力扩弓及机械扩弓两种扩弓方法均能增加腭中缝中SOX9基因的表达,但磁力扩弓对SOX9基因的正向上调作用更强.
【期刊名称】《江西医药》
【年(卷),期】2019(054)004
【总页数】4页(P336-339)
【关键词】SOX9;比格犬;磁力;牵张成骨
【作者】童菲;欧阳志强;郭俊;黄维
【作者单位】南昌大学附属口腔,南昌 330006;南昌大学附属口腔,南昌 330006;南昌大学附属口腔,南昌 330006;江西省抚州市东乡区中医院,抚州 331800
【正文语种】中文
【中图分类】R782.4
上颌牙弓宽度发育不足是正畸临床上常见的错牙合畸形之一，通常需要进行上颌扩弓矫治。

上颌扩弓（Maxillary Expansion）是典型的骨缝牵张成骨，腭中缝在横向的扩张力作用下开张并激发生物学信号的传递进而促使骨组织改建，从而发生引发一系列生物学反应[1]。

上颌扩弓的稳定性也成为正畸界关注热点之一，其与扩弓后腭中缝的骨沉积及新骨形成的速度与量有着直接的相关性。

因此，如何促进上颌腭中缝中的骨沉积及矿化是提高扩弓稳定性的关键所在[2]。

磁力因其舒适性更好、更符合生理性等优点已经成功应用于上颌扩弓的治疗当中。

Blechman等[3]通过研究发现磁力正畸具有加速牙周组织反应，促进牙槽骨改建等优势。

但磁力扩弓时腭中缝内的组织细胞是如何将力学信号转化成生物化学信号的分子生物学机制仍不清楚。

研究表明，SOX9基因与早期骨形成具有高度相关性，是调控软骨细胞增殖和分化的中心。

因此，本研究构建了磁力上颌扩弓的比格犬动物模型，以检测腭中缝牵张成骨过程中SOX9基因的表达情况。

探讨静磁场作用下，该基因在腭中缝牵张成骨过程中如何参与骨组织改建，为正畸临床应用磁力扩弓提供理论基础。

1 材料和方法
1.1 实验动物及分组选取18只6个月龄的雄性比格犬（上海新冈实验动物场提供），体重约8-9kg。

比格犬均处于恒牙列初期，牙列完整无缺损，生长发育状况良好。

分笼饲养在温度和湿度恒定的房间，每日定时定量喂养标准犬粮2次，自由饮水，先适应性饲养1周再进行实验分组。

将所有的比格犬随机平均分为磁力组、机械力组、空白组3组。

所有比格犬均由南昌大学动物实验部饲养，对实验动物的一切处置均符合动物伦理学标准及南昌大学医学院实验动物中心的相关条例。

1.2 主要仪器 PCR仪，冷冻离心机，BIO-RAD电泳仪，-80℃超低温冰箱，LX-200手持式离心机，酶标仪，自动凝胶成像仪，脱色摇床，UV-9100型紫外分光
光度计，电热恒温水浴锅。

1.3 主要试剂 Trizol(Invitrogen公司)，SYBR Premix Ex TaqTM II(TLiRNaseH Plus)(Takara公司 )，PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA
Eraser(Perfect Real Time)（Takara 公司），Premix Taq Version 2.0 （Takara 公司），DL1000 DNA Marker（Takara公司），6×DNA Loadding Buffer
（北京索莱宝科技有限公司），SOX9抗兔多克隆抗体(SantaCruz公司)，琼脂糖，无核酶水，三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇。

1.4 实验方法
1.4.1 建立比格犬上颌扩弓模型参考本课题组前期研究的实验方法[4]：⑴以
1ml/kg的剂量腹膜内注射2%戊巴比妥钠溶液，对两扩弓组比格犬行全身麻醉后，用自凝塑料制作比格犬的上颌个别托盘，并用2次印模法制取上颌硅橡胶印模，
模型灌注后制作磁力扩弓矫治器和螺旋扩弓矫治器。

⑵在扩弓器制作完成后，通过腹膜内注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉比格犬，使用光固化玻璃离子粘结剂将扩弓器粘接于比格犬口腔中。

⑶粘结剂固化后即刻加力，磁力组每周加力1次，每次利
用限位装置加力，每次扩开1.5mm，1周后再次加力，连续加力5次。

机械力组
每周加力两次，每次扩开0.75mm，每周累计扩开1.5mm，间断加力，上颌扩弓
5周。

在实验过程中，仔细观察，如果发现扩弓器脱落或损坏，及时修理并重新粘贴。

1.4.2 标本处理连续上颌扩弓5周后，用戊巴比妥钠进行腹膜内快速注射，处死所有比格犬，并用慢速涡轮手机切割截取上颌腭中缝的标本，标本收集过程中喷水降温以防止局部过热而影响标本的生理活性。

骨组织标本截取范围：矢状方向是从上颌第二前磨牙的远端到第四前磨牙的近端，在冠状方向上距离腭中缝左侧和右侧约
1cm范围。

用生理盐水冲洗骨组织标本并去除骨组织上的软组织。

修剪骨组织并
截取约1.5cm（冠状向）×3.5cm（矢状向）尺寸的骨组织块。

将骨组织标本剪碎置入冻存管，并存于液氮罐内备用。

1.4.3 比格犬腭中缝组织中SOX9表达水平的荧光定量PCR检测取出储存在液氮
罐中的冷冻管中的碎骨片，称量200mg并置于研钵中，并快速加入液氮以研磨形成骨粉。

将骨粉转入1.5ml Rnasefree EP管中，加入1ml Trizol试剂，反复吹打混匀，室温静置5min，将匀浆液于4℃12000r/min离心10min。

将上清液转移到EP管中，加入0.2ml氯仿，颠倒摇动 15s，在冰上静置 5min，并在4℃以12000r/min离心15min。

取上层水相至另一EP管内。

再行1次氯仿抽提。

将200μl异丙醇和200μl高盐溶液加入到第二次提取的第二水相中。

颠倒摇晃并置
于-20°C的冰箱中过夜以沉淀RNA。

第2d，将其从冰箱中取出并解冻，然后在4℃以12000r/min离心15min。

此时，在管底部观察到凝胶状沉淀物，弃上清液。

将75%乙醇1ml加入EP管轻微振荡，小心洗涤洗濯RNA的沉淀，在4℃以12000r/min离心4min，然后弃去上清液。

在空气中干燥5-10min，然后加入
20μl不含核酶的水以将RNA溶解到EP管中。

以12000r/min的转速4℃离心
10min，然后弃上清液。

在空气中干燥5-10min，然后加入20μl无核酶水以将RNA溶解。

在60°C孵育10min以帮助溶解，然后将其置于-80°C冰箱中储存。

犬源SOX9基因序列获自Genebank，Primer 3.0软件用于设计引物序列，并由
上海生物技术有限公司委托进行合成。

SOX9引物信息：(F 5"ACCCGGATTACAAGTACCAGC；R 5"GGGGGAAATGTGCGTC)，应用荧光定量PCR仪对SOX9基因用荧光定量PCR进行扩增，并按反转录试剂盒的说明书进行具体操作。

PCR扩增结束后，保存实验数据和图表，分析SOX9基因扩增和溶
解曲线，计算SOX9 mRNA表达的相对量。

1.5 统计方法实验数据应用SPSS 19.0统计分析软件进行统计分析，所有测量数
据均以mean±SD表示。

3组的组间数据差异采用单因素方差进行分析。

检验水准均为α=0.05。

2 结果
2.1 比格犬饲养及上颌扩弓情况在实验过程中，实验组比格犬的体重在上颌扩弓的第一周减少。

这可能与首次佩戴扩弓器时存在不适感而影响进食有关，但体重在第二周后恢复正常。

磁力扩弓器和螺旋机械扩弓器在实验过程中均粘固良好，未发现明显的变形和脱落。

经过5周的扩弓，经本课题前期实验研究发现两扩弓实验组的腭中缝均显著扩大，且扩弓效应相近[4]。

2.2 SOX9基因mRNA表达相对量的3组间比较与空白组相比，磁力组及机械力组中的SOX9 mRNA表达明显增多（P<0.01），提示在牵张成骨过程中，腭中缝骨组织改建较为活跃。

磁力组与机械力组相比较时，磁力组的SOX9 mRNA表达量相对较多，且差异具有统计学意义（P<0.05），提示在上颌扩弓过程中，磁力组的骨组织改建较机械力组更为活跃（见表1）。

表1 SOX9基因mRNA表达相对量的组间比较分析注：*均值差的显著性水平为0.05。

.000.000.000.024.000.024(I)组别对照组螺旋组磁力组(J)组别螺旋组磁力组对照组磁力组对照组螺旋组均值差(I-J) 标准误显著性-1.956*-3.032*1.956*-1.076*3.032*1.076*.113.113.113.113.113.113
3 讨论
3.1 上颌扩弓对腭中缝骨改建的影响上颌扩弓是牵张力刺激下的骨缝牵张成骨过程。

在牵张力的作用下，成骨细胞大量增殖分化，骨缝边缘新骨形成加速，从而骨量增加。

扩弓过程中，矫治器产生的扩张力克服上颌腭中缝组织的回弹力并激发生物学信号，从而发生一系列生物学反应，促进组织改建，最终使腭中缝软骨组织被骨组织所代替，最终达到增加骨量的目的[5]。

Kuroda等[6]对大鼠进行螺旋上颌扩弓发现，扩弓后腭中缝边缘新骨形成较为活跃。

Peptan等[7]对兔的前颌上颌缝
施以周期性牵张力，发现牵引组的前颌上颌缝的宽度明显宽于自然生长组，此外，骨组织中的破骨细胞数量明显减少，而成骨细胞数量显著增多。

本研究通过对比研究发现不论是磁力扩弓还是螺旋扩弓都能显著促进腭中缝成骨。

3.2 磁场对腭中缝骨组织改建活动的影响当将磁性材料应用到口腔时，诸如牙周韧带和牙槽骨等相邻组织将会受一定强度的静磁场的作用。

静磁场是如何对骨改建活动产生影响的呢？学者们已经证实，磁场作用下，成骨细胞的增殖，分化和基质合成显著提高[8，9]。

Hirose等[10]认为静磁场能对成骨细胞细胞膜起作用并改变细胞内cAMP浓度，从而引发一系列蛋白质磷酸化反应，从而改变细胞内信号的传导并将刺激信号传递至细胞核内以促进细胞分裂和增殖。

磁场因其能促进成骨而应用于骨质疏松的治疗当中，取得较好的治疗效果[11]。

口腔正畸学领域的研究表明，静磁场可以增强骨组织的微循环，加速骨沉积，促进牙槽骨的重建和重建[12，13]。

王胜国等[14]认为静磁场促进细胞增殖的机制可能与细胞内钙浓度的变化有关，静磁场通过改变细胞膜结构改变细胞内钙离子浓度，激活细胞内钙依赖性蛋白激酶，调节核因子，进而调节细胞分裂和增殖。

Chuo等[15]将0.2 T静磁场加载于大鼠骨髓间充质干细胞。

7d后，与对照组相比，静磁场治疗组成骨细胞相关蛋白的表达量显著增加，表明静磁场具有促进骨形成的作用。

3.3 SOX9在骨改建中的作用及在磁力和机械力作用下的表达差异SOX9是细胞分化和肿瘤发生过程中的关键转录因子[16，17]，也是一种重要的早期胚胎发育基因，其表达与早期骨形成高度相关，是调节软骨细胞增殖和分化的核心[18-22]。

Gordon等[23]研究发现SOX9基因上游和下游基因座的突变可发生软骨形成障碍而引发骨骼发育异常，如短指等。

Saitoh等[24]发现对软骨细胞的施以静压可以显著增加SOX9基因的表达，从而促进软骨细胞的分化和增值。

Rabie等[25]对大鼠进行下颌前导，发现与自然生长的对照组相比，髁突软骨和下颌窝SOX9基因的表达明显增加，证明外力刺激可以改变SOX9基因的表达。

韩晶莹[26]等通过扩
弓簧对大鼠进行上颌机械扩弓，结果发现，在牵张成骨过程中大鼠腭中缝SOX9
基因表达显著增加，因而推断SOX9信号分子在扩弓过程中具有重要的意义。

但
机械扩弓与磁力扩弓SOX9基因的表达有无差异，磁场的作用会不会影响SOX9
基因的表达国内外尚未见相关报道。

本实验研究显示：SOX9基因的表达量在机械力组及磁力组均较空白组明显增加（P<0.01），表明两扩弓实验组在扩弓期间腭
中缝骨组织成骨较为活跃，同时也验证了张应力会正向调节SOX9基因的表达。

组间进一步比较发现磁力组的SOX9基因表达大于机械力组，具有统计学意义
（P<0.05），说明磁力组的骨组织改建较为活跃，静磁场有促进骨改建的作用。

本实验的研究结果同样验证了静磁场促进新骨形成和加速骨组织改建的作用。

然而，不同强度的静磁场下SOX9基因的表达有没有差异性有待于进一步研究，以指导
正畸临床合理的使用静磁场。

同时，扩弓后腭中缝骨组织的改建过程实际上是高精度、错综复杂的生命活动，数十甚至数十万细胞，细胞因子，激素等参与了骨形成和骨吸收。

本研究仅对已知的对骨组织改建作用明确的SOX9基因的表达变化进
行了对比研究，在未来的研究中，有必要对静磁场作用下腭中缝骨改建机制开展更全面的相关分子生物学研究。

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