胡萝卜愈伤组织培养及继代培养

（2）愈伤组织继代培养
将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，封口后放置在25℃全黑暗条件进行愈伤组织的继代培养，以获得足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料。
（五）、注意事项
1、调节培养基时，理论上应调至5.8为宜，但因培养基经高温高压灭菌时，蔗糖分解，PH值会有所下降，因此调至6.0可减小误差。
5.掌握组培室常用的化学试剂。
6.学会设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。
7.熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术。
8.使同学熟练掌握胡萝卜细胞悬浮培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术。
9.使同学了解胡萝卜愈伤组织器官分化培养的基本操作技术。
（二）、实验原理、实验流程或装置示意图
1、实验原理
②药品：
NH4NO3、KNO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、FeSO4·7H2O、Na2-EDTA·2H2O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇(维生素B6)、盐酸硫胺素(维生素B1)、甘氨酸、蒸馏水。
④金属用具灭菌：灼烧灭菌。具体方法是：浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用。
⑤接种室灭菌：紫外灯照射、空气消毒灭菌。
超净工作台：紫外灯照射，70%—75%的酒精擦洗。
⑥外植体灭菌：
水冲洗10—20min或更长时间70%—75%酒精中浸泡30s0.1%—0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸馏水冲洗4—5次备用。
愈伤组织继代培养基、75％酒精、蒸馏水。
(四)、实验方法步骤
1、MS母液培养基的配置
配置过程以课本33页的配方图为标准。
（1）大量元素的配置(CaCl2·2H2O要在最后单独加入)
用量=放大倍数*体积*培养基中的浓度
n=20 v=1L
（2）微量元素的配置(Fe单独配置)
N=200 v=1L
（3）有机成分的配置（单一母液）
（2）配置胡萝卜愈伤组织诱导培养培养基所需的仪器设备和药品：
①仪器设备：
冰箱、普通天平、三角瓶、移液管、量筒、烧杯、容量瓶、玻璃棒、医用口杯、精密pH试纸（pH5.4~7.0）、药勺、称量纸、标签纸、封口膜、橡皮筋、电炉、高压蒸汽灭菌锅等。
②药品和试剂：
MS培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸馏水、1mol/LHCl、1mol/LNaOH
（5）培养基的灭菌消毒
灭菌时，压力表读数为0.11MPa,温度121℃时保持30分钟左右即可。为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压之前应先将灭菌锅内的冷空气放尽。排净冷空气的方法：可事先打开放气阀，煮沸等大量热蒸汽排出后再关闭；也可采用先关闭放气阀，待压力升到一定时打开放气阀排出空气，再关闭放气阀。
（6）培养基冷凝后，标记，并置于暗处放置3-7天备用。
2、实验流程
（1）实验总体流程：
（2）无菌操作流程：
（3）胡萝卜愈伤组织诱导培养流程：
(4)胡萝卜愈伤组织的继代培养流程：
（三）、实验设备及材料
1、实验材料
新鲜的胡萝卜贮藏根
2、实验设备
（1）配制MS母液培养基所需的仪器设备和药品：
①仪器设备：
电子天平、烧杯、容量瓶、细口瓶、药勺、玻璃棒、电炉、量筒。
一．实验设计方案
物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料的生长有很大的影响。此外，PH还影响到琼脂培养基的凝固情况。所以，当培养基配制好后应立即进行PH值的调整。培养基若偏酸时用氢氧化钠（1mol·L-1）来调节，若过碱就用盐酸（1mol·L-1）来调整。当PH值高于6.0时，培养基将会变硬；当PH值低于5.0时5.0时，琼脂不能很好地凝固。
实验名称
胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
实验时间
2013年3月-6月
实验室
组培实验室
（一）、实验目的
1.熟练掌握配制与保存培养基母液的基本技能。
2.熟练掌握培养基配制的基本技能，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。
3.学会设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。
4.熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术。
②、培养瓶封口后置于恒温培养箱中全黑暗培养。温度控制在25℃左右。
③、接种结束后，清理和关闭超净工作台。
4、胡萝卜愈伤组织的继代培养
（1）、准备工作
接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于超净工作台）。
（3）胡萝卜愈伤组织诱导所需设备：
①仪器设备：
100ml三角瓶、500ml搪瓷杯、25ml量筒、10ml和5ml吸管、pH试纸（5.4~7.0）、封口膜、扎口用棉线、药勺、称量纸、酒精棉球、小块纱布、已灭菌滤纸、枪状镊子、手术剪、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精灯、培养瓶、镊子、解剖刀等。
②药品和试剂：
MS基本培养基母液、愈伤组织诱导培养基、蒸馏水、无菌水、75％酒精、蔗糖琼脂、NAA、6-BA、水解酪蛋白、1mol/LHCl、1mol/LNaOH、0.1%HgCl2。
5.实验材料大小应适中，不宜太大或太小。
6.实验中接种过程要在操净工作台进行，接种前，实验所用的所有器械及手均需严格消毒灭菌。
7.切胡萝卜时，下面应垫上滤纸。
8.接种时，动作要轻，力度适中。不要把接种的切块压入培养基里面，以致破坏培养基。
9.接种时瓶口应倾斜45度，以免手、镊子上的赃物容易掉到三角瓶里。
2.防火。实验中要经常用酒精消毒、用酒精灯烧镊子、刀具，注意安全。
3.无菌操作。材料经HgCl2消毒后，即认为是消毒干净，此后的操作中的用具要求无菌。为防止染菌，注意：手要用酒精擦干净；镊子和刀经常在火焰上烧；锥形瓶、手不要放在盛材料的培养皿上方。
4.废液处理。酒精要回收，放原处；HgCl2有剧毒，小心不要溅出，废液使用后应按要求放到指定位置。
配制流程：
(1)根据需要配制培养基的量（各小组500ml）称好所需的琼脂放入医用口杯中，加入适量的蒸馏水置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅拌。
(2)待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液（可事先取好放在一烧杯中），再加入规定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需的生长调节物质，定容至所需的体积，并用玻棒搅拌均匀。
④、用沾有70%—75%酒精的纱布擦拭盛培养基的培养器皿，放进工作台。
⑤、把解剖刀、剪刀、镊子等器械浸泡在95%的酒精中，再在火焰上消毒，放在器械架上。
⑥、在酒精灯火焰附近切割备用的接种材料。
⑦、打开瓶口，用火焰烧瓶口，转动瓶口使瓶口各部分都烧到。
⑧、取下接种器械，在火焰上消毒。
（3）、植物材料表面的灭菌与接种
（1）配制培养基时，为了使用方便和用量准确，通常采用母液法进行配制，即将所选培养基配方中各试剂的用量，扩大若干倍后再准确称量，分别先配制成一系列的母液置于冰箱中保存，使用时按比例吸取母液进行稀释配制即可。
（2）愈伤组织（callus）原指植物体的局部受到创伤刺激后，在伤口表面新生的组织。它由活的薄壁细胞组成，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，迸而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。
常用的化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌。
不同物品要选用不同的灭菌方法。
实验室中常用仪器设备及其灭菌方法如下：
①培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法。具体方法如下：压力在9.8×104—10.8×104Pa，温度在121℃，灭菌20—30min。
②玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌、干热消毒灭菌
③塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌
（4）灭菌过程中，应尽量保持压力恒定，严格遵守灭菌时间；
3、胡萝卜愈伤组织诱导
（1）、实验材料的准备
①、材料的修整、刷洗、冲洗。
②、用小刀刮去胡萝卜外表皮，横切取高约1cm的圆柱形胡萝卜块3块。
（2）、准备工作
①、打开超净工作台和无菌操作室的紫外灯，照射40min左右，后关闭。
②、开启过滤室风机，使无菌风吹拂工作台面和四周的台壁。
③、用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手。
本科学生综合性实验报告
学号：*********姓名：段昌福
学院：生命科学学院专业、班级：10应用生物教育B班
实验课程名称：胡萝卜肉质根愈伤组织诱导、继代增殖、细胞
悬浮及体细胞胚胎发生培养实验
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开课学期：2013至2014学年第二学期
填报时间：2013年6月日
云南师范大学教务处编印
实验序号
实验二
10.操作期间应经常用70%—75%的酒精擦拭工作台和双手；接种器械应反复在95%的酒精中浸泡和在火焰上消毒。
11.灭菌锅有很多种，实验室中常用手提式高压蒸汽灭菌锅，使用时要注意以下几点：
（1）锅中应放足量的水，以免造成空烧或干烧；
（2）装锅时不要过度倾斜，可保持内部有一定的空间，利于蒸汽流动；
（3）增压前高压锅内的空气必须排净，否则易影响灭菌效果；
愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类，而是培养条件，其中激素的种类和浓度最为重要。诱导愈伤组织常用的生长素是2，4-D，IAA和NAA，常用的细胞分裂素是KT和6-BA。
愈伤组织形成的过程分为3个时期：诱导期、分裂期、分化期（形成期）。愈伤组织的生长是发生在不与琼脂培养基接触的表面。