sanger测序培训PPT最终精讲
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sanger测序---基因检测的 金标准
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
曹尚志
sanger测序原 理
• 双脱氧末端终止法
• 引物设计 • 实验流程 • 上机测序
Sanger测 序的基本 流程
测序结果 的分析
• 怎样分析结果 • 问题峰图分析
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
峰图出现断层（可先重跑看是否解决，需要换Buffer）
Raw：
Electropherogram（电泳图、QV正常）
毛细管堵塞导致拖尾（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram（展开图正常）
毛细管堵塞导致宽峰（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram：
1.根据rs号得到位点信息及目标序列 2.引物设计
3.测序PCR模板的制备
4. 测序样品的制备 5.上机测序
1.根据rs号得到位点信息及目标序列
2.引物设计
2.1 primer primer 5.0
+
2.引物设计
2.2 引物特异性检查
2.3 设计引物还需注意
引物纯度（PAGE纯化方式） 不能使用兼并引物测序 测序引物位置距离位点最多600bp，至少50bp 避免荧光标记 测序引物长度16-25bp，TM值50-65℃为宜,55℃最佳 测序引物位置避免Poly（A.T）和高GC结构
Raw：
Electropherogram：
信号弱（有较完整峰型、信号值较低、峰图部分可信）
Raw：
Electropherogram：
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图
样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
poly（A、T）结构导致后双峰
测序PCR与普通PCR的区别
5. 上机测序
5.1 测序样品变性
pcr扩增仪器中95℃变性4min。 .
5.2 上机操作
三、 测序结果分析
怎样看测序结果
怎样得到位点基因型
常见峰图介绍
保证测序结果的准确性
1.怎么看峰图（分析软件Sequence Analysis）
峰图判断三要素：电泳图(Electropherogram)、峰图(Raw)、QV值
电泳图/QV值 峰图
Raw：峰图
Electropherogram：电泳图
QV值 QV值越高，读图越准确。 QV值为蓝色，表示可信。 QV值为黄色，表示不准确，需要人工判读。 QV值为红色，表示不可信 QV值
2.怎样得到位点基因型（分析软件Chromas）
根据得到位点信息，将位点3‘保守序列（10个碱基左右），在软件中Chromas 查找，前面即为突变基因型。 PS:如果是反向引物测序需要将测序结果反向互补
5’ 3’
ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP 的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同 长度的新的DNA片段。
5’
3’
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
二、Sanger测序的实验基本流程（以MTHFR(RS1801133)检测为例）
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号、信号弱测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
正常峰图（有完整峰型、单一峰尖锐独立、QV值基本上为蓝色)
Raw：
Electropherogram：
无信号（无完整峰型、无信号或信号值较低、峰图杂乱无章、绝大部分不可信）
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
染料峰（纯化操作不规范或者ddntp过量）
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
3.测序PCR模板的制备 稀释引物
根据合成回来的引物浓度稀释，一般工作 液10umol/ul(4℃保存)，母液100umol/ul（ -20℃保存）
3.1 PCR扩增
设计方案
1.PCR扩增三步法：变性--退火--延伸 2.退火温度：(Ftm+Rtm)/2-5 3.延伸时间：1kb=1min
pcr仪扩增
•PCR反应的优化程 •PCR产物的质量 选择最佳的纯化方法
1.柱纯化：用于特异PCR产物纯化或存在 <100bp的非特异产物的纯化 (如：引物二聚体) 2.切胶回收：可用于任何质量的PCR产物纯化 切下条带，去除非特异PCR产物和引物二聚体
4.测序样品制备
测序PCR
测序产物 纯化
测序PCR（以回收PCR产物为模板）：96 ℃1 min -(96 ℃ 10 sec 50 ℃ 5 sec - 60 ℃ 4 min) x 25循环-4 ℃保温 酒精/EDTA/NaAc法：•去除残留的BigDye Terminator(染料 峰) •测序产物脱盐 •纯化好的测序产物比较稳定
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
引物降解或者不纯
Raw：
Electropherogram：
Than源自文库s！
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
根据设计好的参数，设置使用PCR仪器扩 增.
3.2 PCR产物纯化
纯化的意义
去除PCR反应液的 残留
1.残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序 2.残留的dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs的最佳 比例 3.盐成分：避免抑制测序酶活性 4.非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域
依赖于
纯化（试剂盒） 方式选择
Raw：
Electropherogram：
返回
测序信号中断（二级结构导致）
Raw：
Electropherogram：
返回
序列结构高GC导致信号衰减
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
曹尚志
sanger测序原 理
• 双脱氧末端终止法
• 引物设计 • 实验流程 • 上机测序
Sanger测 序的基本 流程
测序结果 的分析
• 怎样分析结果 • 问题峰图分析
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
峰图出现断层（可先重跑看是否解决，需要换Buffer）
Raw：
Electropherogram（电泳图、QV正常）
毛细管堵塞导致拖尾（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram（展开图正常）
毛细管堵塞导致宽峰（可先重跑看是否解决，或者清理毛细管）
Raw：
Electropherogram：
1.根据rs号得到位点信息及目标序列 2.引物设计
3.测序PCR模板的制备
4. 测序样品的制备 5.上机测序
1.根据rs号得到位点信息及目标序列
2.引物设计
2.1 primer primer 5.0
+
2.引物设计
2.2 引物特异性检查
2.3 设计引物还需注意
引物纯度（PAGE纯化方式） 不能使用兼并引物测序 测序引物位置距离位点最多600bp，至少50bp 避免荧光标记 测序引物长度16-25bp，TM值50-65℃为宜,55℃最佳 测序引物位置避免Poly（A.T）和高GC结构
Raw：
Electropherogram：
信号弱（有较完整峰型、信号值较低、峰图部分可信）
Raw：
Electropherogram：
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图
样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
poly（A、T）结构导致后双峰
测序PCR与普通PCR的区别
5. 上机测序
5.1 测序样品变性
pcr扩增仪器中95℃变性4min。 .
5.2 上机操作
三、 测序结果分析
怎样看测序结果
怎样得到位点基因型
常见峰图介绍
保证测序结果的准确性
1.怎么看峰图（分析软件Sequence Analysis）
峰图判断三要素：电泳图(Electropherogram)、峰图(Raw)、QV值
电泳图/QV值 峰图
Raw：峰图
Electropherogram：电泳图
QV值 QV值越高，读图越准确。 QV值为蓝色，表示可信。 QV值为黄色，表示不准确，需要人工判读。 QV值为红色，表示不可信 QV值
2.怎样得到位点基因型（分析软件Chromas）
根据得到位点信息，将位点3‘保守序列（10个碱基左右），在软件中Chromas 查找，前面即为突变基因型。 PS:如果是反向引物测序需要将测序结果反向互补
5’ 3’
ddNTP被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个dNTP 的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止。 在引物等延伸反应过程中，ddNTP在不同位置掺入，产生了一系列不同 长度的新的DNA片段。
5’
3’
一、Sanger测序原理——双脱氧末端终止法
二、Sanger测序的实验基本流程（以MTHFR(RS1801133)检测为例）
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号、信号弱测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图 测序仪器影响及测序峰图 纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
正常峰图（有完整峰型、单一峰尖锐独立、QV值基本上为蓝色)
Raw：
Electropherogram：
无信号（无完整峰型、无信号或信号值较低、峰图杂乱无章、绝大部分不可信）
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
染料峰（纯化操作不规范或者ddntp过量）
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
3.测序PCR模板的制备 稀释引物
根据合成回来的引物浓度稀释，一般工作 液10umol/ul(4℃保存)，母液100umol/ul（ -20℃保存）
3.1 PCR扩增
设计方案
1.PCR扩增三步法：变性--退火--延伸 2.退火温度：(Ftm+Rtm)/2-5 3.延伸时间：1kb=1min
pcr仪扩增
•PCR反应的优化程 •PCR产物的质量 选择最佳的纯化方法
1.柱纯化：用于特异PCR产物纯化或存在 <100bp的非特异产物的纯化 (如：引物二聚体) 2.切胶回收：可用于任何质量的PCR产物纯化 切下条带，去除非特异PCR产物和引物二聚体
4.测序样品制备
测序PCR
测序产物 纯化
测序PCR（以回收PCR产物为模板）：96 ℃1 min -(96 ℃ 10 sec 50 ℃ 5 sec - 60 ℃ 4 min) x 25循环-4 ℃保温 酒精/EDTA/NaAc法：•去除残留的BigDye Terminator(染料 峰) •测序产物脱盐 •纯化好的测序产物比较稳定
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图
引物降解或者不纯
Raw：
Electropherogram：
Than源自文库s！
上海吉凯基因化学技术有限公司 Shanghai Genechem Co., Ltd.
根据设计好的参数，设置使用PCR仪器扩 增.
3.2 PCR产物纯化
纯化的意义
去除PCR反应液的 残留
1.残留的引物：保证引物特异性，避免多重测序 2.残留的dNTP:以保持dNTPs / ddNTPs的最佳 比例 3.盐成分：避免抑制测序酶活性 4.非特异PCR产物：避免扩增出同源性区域
依赖于
纯化（试剂盒） 方式选择
Raw：
Electropherogram：
返回
测序信号中断（二级结构导致）
Raw：
Electropherogram：
返回
序列结构高GC导致信号衰减
Raw：
Electropherogram：
返回
3.常见峰图介绍及分析
正常及无信号测序峰图 样品内部结构影响及测序峰图
测序仪器影响及测序峰图
纯化因素影响及测序峰图 引物质量影响及测序峰图