动物组织标本制作技术及注意事项

动物组织标本制作技术

第一章：取材及固定

一、动物致死法

1、麻醉法

第二章可将浸有乙醚或氯仿的棉球连同小动物一起密封于钟罩或有盖玻璃瓶内进行麻醉；也可用4%戊巴比妥作静脉注射，剂量按动物体重1ml/kg；或用20%氨基甲酸乙脂作腹腔注射，剂量一般按动物体重5ml/kg。

2、空气栓塞法

如家兔可用50ml注射器将空气由耳静脉推入，使动物很快死亡。

3、击头法

如大、小鼠，可用重物击头后部或将其头后部猛撞桌沿，最好一击而死。

4、断头法

青蛙、小鼠等小动物，可用剪刀剪去其头部，较大动物如兔子等，可用斧头迅速砍头致死。

5、股动脉放血法

动物经吸入乙醚或氯仿稍麻醉后，立即切开股动脉放血。

注意：上述各法，应根据制片需要选用，如空气栓塞法不宜用作血管注射标本的制作；乙醚麻醉对丘脑下神经部分泌物染色标本不利；股动脉放血法有利于肠系膜铺片的制作。

二、取材注意事项

1、材料新鲜

最好是动物心脏还在跳动时取材，立即投入固定液内，脏器的上皮组织最易变质，应争取在死后半小时内处理完毕。

2、组织块力求小而薄

组织块的厚度以不超过5毫米为宜，较理想的厚度为2毫米左右，主要目的是使固定液迅速而均匀的渗入组织块内部。

3、勿使组织块受挤压

切取组织块时刀剪要锋利，不要来回挫动，夹取组织时切勿猛压，取材时组织块可稍大，以便固定后修块。

4、尽量保持组织的原有形态

新鲜组织经固定后，或多或少产生收缩现象，为此可将组织展平，以尽可能维持原形。

5、要熟悉取材部位

要能准确的按解剖部位取材，如胰腺，一般取胰岛较多的胰腺尾部；肺应取有细支气管及带有软骨片的小支气管部。

6、动物品种的选择

如观察肥大细胞，以大、小鼠皮下组织及肠系膜、大网膜铺片为佳，欲观察运动终板，可用小鼠的肋间肌等。

7、选好组织块的切面

熟悉某些器官组织成分安排，然后决定其切面的走向；如一长管状器官以横切面较好。

8、保持材料的清洁

组织块上如有血液、污物、粘液、食物、粪便等，可用生理盐水冲洗，然后再入固定液，但要注意防止组织损伤。9、切除不需要的部分

特别是组织周围的脂肪等，应尽可能清除掉，否则给固定、脱水、浸蜡、切片等带来一些不必要的问题。

三、组织固定法

（一）、固定的方法

1、小块组织固定法：从人体和动物取下的小块组织，立即置入液态固定剂中进行固定，这是应用最广泛最经常的方法。

2、注射、灌注固定法：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定。这时宜采用注射固定法，将固定液注入血管，经血管分支到达整个组织和全身，从而得到充分的固定。

3、蒸汽固定法:比较细小而薄的标本，可用锇酸或甲醛蒸汽固定。主要用于血液或细胞涂片以及某些薄膜组织的固定。（二）、固定的目的

1、迅速阻止组织、细胞的死后变化，防止自溶与腐败，使之尽量保持生前的状态与结构。

2、使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持其原有状态。

3、使组织内各种物质成分产生不同的折光率，以便染色后易于鉴别和观察。

4、使组织块在脱水、包埋、切片、染色等过程中不易损坏。

5、使不同组织成分对染料有不同的亲和力，经染色处理后易于辨认。

6、防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。

7、使组织块硬化，便于制作薄片。

（三）、注意事项及影响固定的因素

1、组织块不易过大，一般以厚度5mm，长宽不超过15×15mm。

2、固定液的量一般以组织块大小的20倍为宜。

3、必须选择渗透力强，又不使组织过渡收缩或膨胀的试剂作为固定液。

4、有的固定剂是由氧化剂与还原剂混合而成，如甲醛（还原剂）与重铬酸钾（氧化剂）混合成的Helly液等。

5、固定时间的长短视固定剂的不同要求而定，也与气温、组织块的大小有关。温度高时则时间缩短，组织块过大则应延长固定时间。

6、软组织或较大组织可先经2-3小时固定后再修整成小块重新投入新配制的固定液内继续固定。

7、特殊要求的组织，常需要特殊的固定液，所以，取组织之前应做好准备。如各种神经组织因显示内容不同，需不同的固定液与固定方法。

（四）、固定液

1、固定液种类：一类是单纯固定液，即只有一种试剂；另一类是混合固定液，由两种或两种以上试剂组成。

作为较好的固定液，应有下列特性，首先，有强渗透力，能迅速的渗入组织内部；其次，不使组织过渡收缩或膨胀，并能使组织内欲观察的成分得以凝固为不溶性物质；最后，能使组织达到一定的硬度并获得较佳的折光率和对某些染料具有较强的亲和力。

2、单纯固定液

（1）酒精：既是配制混合固定液的基本成分，又可作为单纯固定液使用。用于固定时以80%-95%浓度为好。缺点是经酒精固定的组织容易变硬，对组织收缩较大。

（2）甲醛水溶液：常用的甲醛水溶液即市售的福尔马林，常用浓度为10%，指以10ml的商品甲醛（37%-40%甲醛水溶液）加入90ml水配成的，此液实际上只有4%的甲醛。

（3）醋酸：亦名乙酸，能与酒精、水、氯仿等多种试剂混合，故为许多混合固定液成分之一，其穿透速度很快，固定小组织仅1h即可，对组织和细胞有膨胀作用，且不能凝固细胞质中的蛋白质，一般与引起收缩的固定液一起使用，以达到平衡目的。

（4）苦味酸：苦味酸能沉淀蛋白质，对脂肪、类脂无作用，渗透力较弱，很少单独使用，固定后收缩明显，用含苦味酸的固定液固定组织一般不宜超过24小时。

（5）重铬酸钾：其穿透速度快，对组织收缩小并稍有膨胀，重铬酸钾常备水溶液为3-5%。其混合固定液，如Zenker 液、Helly液及Regaud液等被广泛用于组织学，凡经重铬酸钾、铬酸、铬酸盐固定的组织，必须以流水冲洗后方能转入脱水剂。

（6）锇酸：锇酸一般只用于某些特殊染色或电镜切片染色或固定，配制时要用洗涤干净的玻塞棕色瓶，最好用双蒸水配制，锇酸穿透力弱，且易使组织硬脆，因此它固定的组织必须小而薄，体积最好在3×3×2mm以内。

（7）铬酸：铬酸能沉淀蛋白质，适用于核蛋白的固定，并能增强核的染色能力，穿透速度慢，一般组织块的固定，需经12-24h，硬化程度中等，收缩显著，除用作固定液外，万分之一的铬酸水溶液，可制作分离标本。

（8）丙酮：丙酮能使蛋白质沉淀，渗透力强，但对核固定欠佳，且使组织剧烈收缩。广泛用于组织化学中酶的固定，其作用基本与酒精相同。

（9）三氯醋酸：作用与醋酸相似，很少单独使用，在混合固定液中对组织起膨胀作用。

3、常用混合固定液

（1）Bouin液：饱和苦味酸水溶液：75ml；甲醛水溶液（40%）：25ml；冰醋酸：5ml。三者在配方中的实际比例为1：5：15，为实验室常用固定剂，其渗透力强，对组织固定均匀且收缩较小，染色效果好。冰醋酸固定染色质，苦味酸使组织适当硬化，甲醛水溶液调节两种试剂对组织的膨胀作用。其固定时间以12-24h为宜。

（2）Carnoy液：冰醋酸一份，氯仿三份，无水酒精六份。此液浸透速度快，固定时间不宜过长，小块组织2-3小时即可，固定后直接入无水酒精脱水。常用于糖原及尼氏体固定。一般固定时须放在冰箱中，低温环境可明显减少收缩作用。（3）中性甲醛液：最常用的固定液之一，配方:40%甲醛120ml,蒸馏水880ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g，pH7.0。（4）中性缓冲甲醛液：为免疫组织化学最常用的固定液。固定时间24h为宜，配方：40%甲醛10ml，0.01mol/LpH7.4的PBS90ml