分子生物学基本操作
DNA的基本分子生物学操作汇总
Sanger测序法利用DNA聚合酶和四种不同脱氧核糖核苷酸（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）的特异性，通过分 别标记四种脱氧核糖核苷酸并在不同反应管中分别添加不同的荧光标记，实现DNA序列的逐一合成和检测。该方 法具有高准确性和高分辨率的特点，但测序长度有限制。
下一代测序技术
总结词
DNA的基本分子生物学 操作汇总
• DNA的提取 • DNA的限制性酶切 • DNA的连接 • DNA的转化 • DNA的克隆与表达 • DNA的测序与分析
01
DNA的提取
细胞裂解
机械法
通过机械方式破碎细胞壁，常用的方法有超声波 破碎和玻璃珠研磨等。
化学法
使用化学试剂如盐酸、氢氧化钠等改变细胞膜通 透性，使细胞内容物释放。
离心分离
利用离心机分离酶切产物。
纯化试剂盒
使用纯化试剂盒进行酶切 产物的纯化。
03
DNA的连接
连接酶的种类与特性
EcoRI
T7 DNA Ligase
识别GAATTC序列，切割后产生5'-突 出的粘性末端。
在DNA的5'到3'方向上催化DNA的连 接。
T4 DNA Ligase
能够连接两个DNA片段，形成磷酸二 酯键。
注意事项
感受态细胞的制备需要在无菌条件下进行，避免污染。
DNA的转化过程
转化过程
将制备好的感受态细胞与外源 DNA混合，通过离心、洗涤
和再悬浮等步骤，使外源 DNA进入感受态细胞。
转化效率
转化效率的高低与感受态细胞 的状态、外源DNA的浓度和
纯度等因素有关。
影响因素
转化条件如温度、pH、离子 浓度等也会影响转化效率。
分子生物学基本操作
琼脂糖凝胶电泳 和凝胶成像实验步骤
一、琼脂糖凝胶电泳
凝胶电泳是分离和纯化DNA片段最常用的技术。 根据制备凝胶的材料:
琼脂糖电泳 凝胶 电泳
聚丙烯酰胺电泳
琼脂糖的孔径大，可以分离长度为100bp至60kb的核酸片断； 聚丙烯酰胺凝胶的孔径小，可分离小片断（5-50bp）的核酸。
1、实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成 具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂 糖的浓度。
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头
比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips Fra bibliotek 不会有残留；
如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）；
与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头；
加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及 外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从 反应体系的管底吸上，反复吹打
多通道枪
混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数
分子操作在加样后、反应前都要充分混匀
一、枪混匀
二、旋涡混匀器
0.2ml管,0.5ml管15% 体积以下
分子生物学实验技术实验操作指南
《分子生物学实验技术实验操作指南》目录1 植物基因序列分析 (3)2 引物设计的原则 (4)3 试剂的配置和灭菌 (5)4 植物基因组DNA的提取 (6)5 DNA的定量 (8)6 DNA的电泳 (9)8 PCR产物的回收 (12)9 PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 (14)10 菌落（液）PCR (17)11 质粒DNA的提取 (19)12 质粒DNA的酶切 (21)1 植物基因序列分析1.基因组DNA（genomic DNA, gDNA）：功能基因包括三个基本序列：5’上游区，转录区和3’下游区。
2.5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。
3.转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序列，经核不均一RNA最终被加工为成熟的mRNA。
4.信使RNA（messenger RNA, mRNA）：由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。
由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴。
5.互补DNA（complementary DNA, cDNA）：具有与某mRNA链呈互补的碱基序列的单链DNA。
6.蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS）：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。
只有外显子，不含内含子。
7.5’非翻译区（5’-untranslated region, 5’UTR）：mRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间顺序。
8.3’非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）：mRNA位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。
2 引物设计的原则1.引物长度：一般为20-25bp。
若产物长度等于或小于500bp，可选用16-18bp的引物；若产物长达5kb，则需要用更长的引物。
分子生物学基本实验操作
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
PCR基本操作包括哪些步骤
PCR基本操作包括哪些步骤PCR（聚合酶链式反应）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段。
它在基因工程、药物研发、疾病诊断等领域具有广泛的应用。
PCR基本操作包括以下几个步骤：1. DNA样本处理与提取PCR反应所需的DNA样本可以从细胞或组织中提取获得。
常用的提取方法包括酚-氯仿法、盐析法、商用DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要进行定量和质量检测，确保PCR反应的可重复性和准确性。
2. 反应体系准备PCR反应体系主要由DNA模板、引物、缩合酶、反应缓冲液和可调节的离子浓度组成。
根据实验需要，可以添加特定的辅助试剂、核苷酸等。
反应体系的设计和优化对PCR反应的灵敏度和特异性有重要影响。
3. PCR反应程序设置PCR反应需要按照一定的温度和时间控制，以使DNA片段在不同温度区间中完成变性、退火和延伸等步骤。
一般情况下，PCR反应的程序包括初始变性、循环反应和最终延伸等阶段。
4. PCR反应条件优化PCR反应的条件优化对于提高扩增效率、特异性和产物纯度至关重要。
优化参数包括反应体系组分、引物浓度、反应温度、扩增周期数等。
通过优化反应条件，可以解决一些常见问题，如非特异性扩增、抑制性物质的影响等。
5. PCR产物分析与检测PCR产物可通过凝胶电泳、定量PCR、测序等方法进行分析和检测。
凝胶电泳是常用的PCR产物分析方法，可以确定目标DNA片段的大小和纯度。
定量PCR则可以精确测量DNA模板的初始量或PCR产物的多少。
通过以上几个步骤，PCR技术可以在较短的时间内扩增目标DNA片段，从而满足各种科研和应用需求。
PCR反应的成功需要仔细的实验操作和条件优化，以保证结果的准确性和可靠性。
实验室分子生物学实验基本操作要求规范及注意事项
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。
（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。
（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。
（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。
（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。
每人负责六个月。
其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。
由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。
二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。
2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。
注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。
在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。
PCR基本操作包括哪些内容
PCR基本操作包括哪些内容引言PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，可以在短时间内扩增特定DNA序列。
PCR的基本原理是通过循环反应来反复复制DNA片段，从而产生大量的目标DNA。
PCR基本操作步骤原料准备•DNA模板：待扩增的DNA模板，可以是基因组DNA、cDNA或其他来源的DNA 片段。
•引物（primers）：与目标DNA序列的两端碱基序列互补，用于扩增特定的DNA片段。
•dNTPs：四种脱氧核苷酸三磷酸盐，即dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
•缓冲液：提供适宜的pH和离子浓度，以维持反应体系的稳定性。
•DNA聚合酶：一种能耐高温的酶，在PCR反应中起到合成新DNA链的作用。
•滋养液：用于调节反应混合物的体积，使反应过程中保持湿润。
PCR反应体系制备1.根据反应体系的需要，将DNA模板、引物、dNTPs、缓冲液、DNA聚合酶和滋养液按照一定比例混合。
2.将混合物转移到PCR管或PCR板中。
反应条件设置1.Denaturation（变性）：将反应体系加热至高温（通常为94-98摄氏度），使DNA双链解开成单链。
2.Annealing（退火）：将反应体系降温至适宜引物结合的温度（通常为40-60摄氏度），使引物与目标DNA序列的两端互补结合。
3.Extension（延伸）：将反应体系升温至适宜DNA聚合酶活性的温度（通常为68-72摄氏度），在每个引物的3’端引导下，合成一条新的DNA链。
反应循环PCR反应通常需要进行多次循环，每个循环包括一系列的变性、退火和延伸步骤。
循环的次数根据需要扩增的目标DNA的数量决定。
结果分析PCR反应完成后，可以通过各种手段来分析扩增产物。
常见的方法包括： - 凝胶电泳：将扩增产物在凝胶上进行分离，根据不同大小的DNA片段在凝胶上的迁移距离进行分析。
- DNA测序：通过对扩增产物进行测序，确定其核酸序列，从而得到更详细的信息。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
分子生物学实验基本技术
分子生物学实验进程
实验一 真核细胞染色体DNA的分离制备 DNA样品的纯化、定量和电泳检测 实验二 大肠杆菌感受态细胞的制备与重组质粒转化 实验三 碱变性法小量制备质粒 DNA的限制性酶切 实验四 琼脂糖凝胶中DNA片段的分离和回收 质粒DNA的连接和转化 实验五 真核细胞RNA的制备和逆转录PCR 实验六 Western印迹（上） 实验七 Western印迹（下） 实验八 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测 实验九 多聚酶链式反应（PCR）反应 实验十 Northern印迹 实验十一 Southern印迹 考试
1966
1972 1973 1973 1977 1977 1982 1986 2001
Finished unraveling the code; Nirenberg & Khorana
Recombinant DNA made in vitro; P. Berg DNA cloned on a plasmid; H. Boyer & S. Cohen Discovery of reverse transcriptase; H. Temin Rapid DNA sequencing; F. Sanger & W. Gilbert Discovery of split genes; Sharp, Roberts et al. Discovery of ribozymes; T. Cech & S. Altman Creation of PCR; K. Mullis et al. Human Genome Project; Venter, Collins and many others
段连接起来构成一个新的DNA分子的过程。
分子克隆（molecular cloning）：重组体分子的无性 繁殖过程。
分子生物学常用实验技术(精)
分子生物学常用实验技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第二章 DNA酶切及凝胶电泳第三章大肠杆菌感受态细胞的制备和转化第四章 RNA的提取和 cDNA 合成第五章重组质粒的连接、转化及筛选第六章基因组 DNA 的提取第七章 RFLP和 RAPD 技术第八章聚合酶链式反应 (PCR扩增和扩增产物克隆第九章分子杂交技术第十章测序技术第一章质粒 DNA 的分离、纯化和鉴定第一节概述把一个有用的目的 DNA 片段通过重组 DNA 技术 , 送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体 (Vector。
细菌质粒是重组 DNA 技术中常用的载体。
质粒 (Plasmid是一种染色体外的稳定遗传因子 , 大小从 1-200kb 不等 , 为双链、闭环的 DNA 分子 , 并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。
质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中,它具有自主复制和转录能力 , 能在子代细胞中保持恒定的拷贝数 , 并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质,如离开宿主细胞则不能存活 , 而宿主即使没有它们也可以正常存活。
质粒的存在使宿主具有一些额外的特性 , 如对抗生素的抗性等。
F 质粒 (又称F 因子或性质粒、 R 质粒 (抗药性因子和 Col 质粒 (产大肠杆菌素因子等都是常见的天然质粒。
质粒在细胞内的复制一般有两种类型 :紧密控制型 (Stringent control和松驰控制型 (Relaxed control 。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制 , 当染色体不复制时 , 它也不能复制 , 通常每个细胞内只含有 1个或几个质粒分子 , 如 F 因子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制 , 在每个细胞中有许多拷贝 , 一般在 20个以上 , 如 Col E1质粒。
在使用蛋白质合成抑制剂 -氯霉素时 , 细胞内蛋白质合成、染色体 DNA 复制和细胞分裂均受到抑制 , 紧密型质粒复制停止 , 而松驰型质粒继续复制 , 质粒拷贝数可由原来 20多个扩增至 1000-3000个 , 此时质粒 DNA 占总DNA 的含量可由原来的 2%增加至 40-50%。
分子生物学实验基本技术
汇报人：
目录
分子生物学实验技 术概述
基因克隆和表达技 术
PCR技术和相关技 术
分子杂交和印迹技 术
基因编辑技术
蛋白质技术和蛋白 质组学
分子生物学实验技 术概述
添加标题
定义：分子生物学实验技术是指在分子水平上研究 生物现象和过程的技术，包括基因克隆、基因表达、 基因突变、基因重组等。
蛋白质组学在分子生物学实验中的应用：研究蛋 白质的功能、调控机制和疾病发生机制等
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PCR技术和相关技 术
原理：通过DNA复制技术，将DNA片段扩增 步骤：包括模板DNA的制备、引物的设计、反应体系的配置、PCR反应的进行等 应用：广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检测等领域 相关技术：包括实时荧光定量PCR、多重PCR、巢式PCR等
原理：逆转录-聚合 酶链反应技术，将 RNA逆转录为cDNA， 再进行PCR扩增
添加标题
Northern印迹技术：用于检测RNA序列，通过电泳将RNA片段分离，然后用放射性标记的探 针进行杂交，最后通过放射自显影检测杂交信号。
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应用：Southern印迹和Northern印迹技术广泛应用于基因克隆、基因表达分析、基因突变检 测等领域。
添加标题
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
优缺点：Southern印迹技术灵敏度高，但操作复杂，耗时长；Northern印迹技术操作简单， 但灵敏度较低。
基因编辑技术
应用：广泛应用于基因功能 研究、疾病治疗等领域
原理：利用Cas9蛋白对DNA进 行切割，形成双链断裂，从而 实现基因编辑
优势：操作简便、高效、精 确，可应用于多种生物体
局限性：存在脱靶效应，可 能导致非目标基因的突变
核酸提取与纯化
核酸提取与纯化1. 引言核酸提取与纯化技术是分子生物学研究中的一项基本操作。
随着分子生物学研究的深入，核酸提取与纯化技术变得越来越重要。
通过提取和纯化核酸，可以从生物样本中分离出DNA和RNA，并用于后续的实验分析，如PCR、测序、基因克隆等。
本文将介绍核酸提取与纯化的基本原理、常用方法以及注意事项，以帮助读者更好地理解和应用这一技术。
2. 核酸提取与纯化的基本原理核酸提取与纯化的基本原理是利用不同物质间的化学和物理性质的差异实现核酸的分离和纯化。
一般情况下，核酸提取与纯化的基本步骤包括细胞破碎、核酸溶解、核酸分离、纯化和沉淀。
下面将逐步介绍每个步骤的原理。
2.1 细胞破碎细胞破碎是核酸提取与纯化的第一步，目的是将细胞破坏，释放出细胞内的核酸。
常见的细胞破碎方法包括机械破碎、化学破碎和酶解。
机械破碎是通过物理力量（如搅拌、振荡、高压等）破坏细胞结构，使细胞内的核酸释放。
化学破碎则是利用化学物质（如酸、碱、溶剂等）破坏细胞膜和核酸结构，使核酸溶解。
酶解则是利用特定酶（如蛋白酶、核酸酶等）降解细胞内的蛋白质和核酸，使核酸得以释放。
2.2 核酸溶解核酸溶解是在细胞破碎后，将核酸从其他组分中溶解出来。
核酸的溶解需要满足一定的条件，如适当的温度、pH值和离子浓度等。
常见的核酸溶解缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、EDTA缓冲液和含有盐的缓冲液等。
这些缓冲液能够提供适当的pH值和离子浓度，有利于核酸的稳定和溶解。
2.3 核酸分离核酸分离是将溶解的核酸与其他杂质分离的过程。
核酸的分离可通过差速离心、柱层析和电泳等方法实现。
差速离心是利用离心力将核酸与其他物质分离的方法。
由于核酸的分子量较大，其在离心过程中沉降速度较慢，从而与其他物质分离。
柱层析则是利用柱状填料的吸附、分配和排除等原理，通过溶液在柱中的流动进行分离，将核酸与其他组分分离。
电泳是利用核酸在电场中的迁移速度的差异进行分离的方法。
2.4 核酸纯化核酸纯化是将分离的核酸进一步纯化，去除可能存在的杂质。
分子生物学基本技术
分子生物学基本技术包括核酸的纯化，体外合成、分子杂交、基因克隆、基因表达研究技术等第一节DNA的体外合成一、DNA的化学合成（无要求）－亚磷酸三酯法DNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。
目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相亚磷酸三酯法为基础设计制造的合成的原理：核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接长。
每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。
合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。
（末端核苷酸的3′-OH与固相载体成共价键，5′-OH被二甲氧基三苯甲基(DMT)保护，下一个核苷酸的5′-OH亦被DMT保护，3′-OH上的磷酸基上氨基亚磷酸化合物活化。
碱基上的氨基用苯甲酸保护。
每延伸一个核苷酸需四步化学反应(1) 脱DMT游离出5′-OH 。
(2) 缩合（偶联反应）：新生成的5′-OH与下一个核苷活化的3′单体缩合成亚磷酸三酯使链增长(3) 盖帽（封端反应）：有少量(小于0.5%)未缩合的5′-OH 要在甲基咪唑或二甲氨基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。
(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷（磷酸三酯）。
上述步骤循环一次，核苷酸链向5′方向延伸一个核苷酸二、聚合酶链式反应技术聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)是一种体外特定核酸序列扩增技术。
一)PCR的基本原理双链DNA热变性成两条单链，降温使反应体系中的两个引物分别与两条DNA单链两侧的序列特异性复性，在合适的条件下，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，利用反应体系中的4种dNTP 合成其互补链(延伸)，在适宜的条件下，这种变性→复性→延伸的循环重复1次DNA的量可以增加1倍，30次循环后，DNA的量增加230倍。
分子生物学研究中的基础实验技术介绍
分子生物学研究中的基础实验技术介绍分子生物学研究在基础科研和生命医学研究中扮演着重要的角色。
飞速发展的分子生物学研究技术以其高效、精准、可重复性的特点成为了生命科学家的必备工具。
让我们一起来了解几种分子生物学研究中的基础实验技术。
1. DNA/RNA提取技术DNA/RNA提取是分子生物学研究的第一步，是从生物样品中获取纯度高的DNA或RNA的方法。
此技术可以应用于蛋白质鉴定、基因组测序和表观遗传学等领域。
常用的DNA提取方法有酚-氯仿法、盐析法和列柱法等。
其中酚-氯仿法简单易行，适用于DNA纯化和分子生物学操作；盐析法适用于大量的DNA提取；列柱法纯度高，适用于对高纯度DNA样品的分离。
RNA提取方法有TRIZOL法、琼脂糖纯化法和磁珠分离法等。
其中TRIZOL法适用于处理多样本，在样品处理时间短、批量大的情况下性能最佳；琼脂糖纯化法操作简单、成本低，适用于处理样品量小且同时提取RNA和蛋白质；磁珠分离法成本较高，但是它的效率和纯度都较高，可以用于小样本RNA提取和mRNA 纯化。
2. PCR技术PCR技术是基于DNA复制和扩增的技术，可用于DNA序列特异性检测、测序、基因表达分析和基因编辑等应用领域。
PCR技术是利用DNA聚合酶的反复循环态增加目标DNA分子的过程，从而扩增目标DNA分子，它是分子生物学研究中必须熟练掌握的基本操作之一。
PCR反应至少含有数量合适的引物、5'磷酸化的DNA模板、聚合酶、核酸酶抑制剂（RNase inhibitor）等组分。
PCR的引物选择是扩增成功的关键，匹配、降寶和引物长度的选择都会影响PCR扩增结果的可靠性。
3. 南方杂交南方杂交是一种测定核酸序列间同源性和差异性的分析方法，适用于在DNA或RNA样品中检测突变、重排和拷贝数变异等事件。
该方法在医学、生态、植物学和动物学等领域应用广泛。
南方杂交技术的基本原理是利用蛋白质-核酸之间的特异性结合，检测序列相似性。
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/pl)用灭菌水稀释4倍(12.5 ng/gl)后分装成10 pl或20 gl：连接酶(solutionl)按5 pl分装；dNTP (10 mM)分装成50 pl；无菌水分装成1 ml；注意：(1)所有分装都必须用已灭菌的管。
(2)所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。
(3)工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。
(4)当你发现你使用的是最后一管(盒)公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。
(5)感受态，氨节青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。
每人负责六个月。
其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。
由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。
二、常见抗生素及IPTG的配置以氨节青壽素为例：1.准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 nil的离心管、0.22 pm水系滤器、注射器、蒸镉水，以上用品均要进行高压灭菌。
2.洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3.称取2 g的氨节青零素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml,轻摇离心管,至氨节青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4.用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100ml的离心管中。
注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5.把100 nil离心管中己除菌的氨节青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 mlo在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6.把做好标记的盛有氨节青霉素的EP管于-20°C保存。
注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨节青孫素(ampicillin)100 mg/ml50 pg/ml~100 pg/ml卡那窃素(kanamycin)10 mg/ml10 pg/nil〜50 pg/inl氯窃素(cliloramphenicol)25 mg/ml12.5 pg/nil〜25 pg/ml链窃素(streptomycin)50 mg/ml10 pg/nil〜50 pg/inl四环素(tetTacyyline )10 mg/ml10 pg/nil〜50 pg/mlIPTG IM0.05-0.6 mM五、基因扩增1.引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成(jman@)。
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注意事项：
EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 实验过程中操作要保持安静，注意样品不能混样。
2、实验步骤
⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中，摇匀， 在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。
⑵ 将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。 将冷却到65℃左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地 倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整 个玻璃板表面形成均匀胶层。室温下静置直至 凝胶完全凝固。 ⑶ 充分凝固后小心垂直向上拔出梳子。将凝胶置 入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆 盖凝胶1-2mm。
⑷ 用移液器吸取总DNA或质粒样品xμ l于一次性 手套上，再加入一定量的6X/10X loading buffer，混匀后，小心加入点样孔。每加完一 个样品，应更换一个加样头，以防污染，加样 时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。（注意：加样 前要先记下加样的顺序）。 ⑸ 打开电源开关，调节电压至3-5V/cm，可见到 溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min60min：当指示剂跑过胶板的2/3，可终止电泳。 ⑹ 将凝胶放入EB染液中染色5-10min,用清水稍微 漂洗。 ⑺ 将染色后的凝胶置于紫外透射检测仪上，盖上 防护观察罩，打开紫外灯，可见到发出荧光的 DNA条带。
枪头
装枪头 带手套 灭菌 外包报纸 灭菌后50-70度烘干后使用 带手套
0.1to 10 ul clear Tips
0.5 to 10 ul Clear Tips
1-200 ul clear Tips
1-200 ul Yellow Tips (Universal Fit)
1-200 ul Clear, graduated (Universal Fit),
琼脂糖凝胶浓度与线性DNA分辨范围用. 常用的6X载样缓冲液
Ⅰ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，40%蔗糖水溶液
Ⅱ 0.25%溴酚蓝 ，0.25%二甲苯青 ，30%甘油水溶液
二、凝胶成像
1、具体步骤
1 打开凝胶成像仪电源（机器后部），开电脑； 2 将染色后凝胶用水冲洗后，将凝胶放在透射板正中， 并关严暗仓门，打开紫外灯； 3 打开Quantity one软件，点击basic，File中选择 Get Doc EQ…，调节使图象到达合适亮度、大小及清晰度； 4 待图象最优化时，成像freeze在屏幕上，关闭紫外灯， 点击“Save”保存； 5 关闭软件； 6 打开暗仓门，拉出透射台，凝胶丢弃至专门垃圾桶， 插掉透射板上水迹； 7 关上暗仓门。
DNA的提取过程就是用化学和物理的方法， 使DNA与其他细胞物质分离开来的过程。 一般本实验室采用的有高盐法，CTAB法， 煮沸法。 本次实验采用SDS高盐沉淀法。
菌株划LB平板活化，挑单菌落，接3ml 试管，于30℃剧烈振荡培养过夜至稳定 期。离心收集菌体1ml，然后用等体积 TEN洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 等体积TEN中。 加入200ul溶菌酶（100mg/ml），37℃水 浴1h，再加入300ul 20%的SDS，37℃水 浴至溶液澄清。** 加入1/3体积饱和NaCl剧烈振荡，12000 rpm离心10min。我们的实验中上清就取 1ml,以方便后续实验。
多通道枪
混匀----所有试剂在使用前都要充分混匀; 多数
分子操作在加样后、反应前都要充分混匀
一、枪混匀 二、旋涡混匀器
三、手动混匀: 颠倒混匀: 0.5-1.5ml管 30%-70%体积时,试管 30%-70%体积; 擦边混匀: 0.2-0.5ml管 30%体积以下 0.2ml管,0.5ml管15% 体积以下
酶切后质粒 原质粒
ocDNA 线状DNA cccDNA
3、琼脂糖电泳的优点
（1）琼脂糖含液体量大，可达98-99%，近似自由 电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小。 （2）电泳速度快。 （3）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测 仪作定量测定。 （4）样品易回收，常用于制备。
配制多大浓度的琼脂糖凝胶，要根据被检的 DNA分子大小来确定。一般琼脂糖凝胶电泳 适用于大小在0.1kb～60kb范围内的DNA片段
分子生物学基本操作
手套
原则上不论什么实验都应带手套操作 特别是 无菌操作； 与RNA有关的所有操作； 重要克隆菌的挑单克隆，扩增，保存等
与有毒试剂有关的所有操作，比如染胶时 的EB；提取用的有机试剂（通风橱）；
Pipett
量程:使用合适量程的枪(移液器) 校对:定期 使用: 一定在合适量程范围内使用; 枪头必须插紧, 防止脱落以及吸 样体积不够; 用第一档吸样,打出样品到第二档; 吸样时防止倒吸; 不要水平放置带有枪头的枪; 使用后挂在枪架上,不可以乱放
1-200 ul Clear, Non-Beveled
1-200 ul Yellow, Non-Beveled
1-200 ul Clear, Extra-Long
100-1300 ul Blue Graduated Tips
100-1000 ul Tips, fit Gilson LTS Pipetor
琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效 应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。因 而就可依据DNA分子的大小使其分离。该过程可以 通过把分子量标准参照物和样品一起进行电泳而 得到检测。凝胶电泳不仅可分离不同分子质量的 DNA， 也可以分离相对分子质量相同，而构型不 同的DNA分子。 溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外光照射下 发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其 荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样 品DNA浓度。
细菌DNA的提取
环状双链DNA、不与组蛋白结合（古菌具 有组蛋白类蛋白）、基因总数水平一般为 103-104，一般情况下，一个细胞中只有一 条染色体或一套基因组。
The E. coli genome is a circular double-stranded molecule of DNA; this DNA molecule is 4,639,675 base pairs in length and encodes 4267 genes.
0.1-10 ul Sterilized Micro-filter Tips
加样-使用合适的枪与枪头
比如加含有甘油的试剂，酶等最好用clear Tips 它 不会有残留； 如果甘油含量高，或特别浓稠的试剂最好用Clear, Non-Beveled Tips（或将一般枪头去尖头）； 与RNA操作有关的枪头最好为Sterilized Micro-filter Tips，或者至少为用DEPC水处理的枪头； 加样体积应为枪头最大体积的20%-100%，低于该 范围的用小一号的枪头；大于该范围的可以用同 样的枪头加样两次（两次体积相当，比如加210ml, 可以用200ml枪头以105ml加两次）；
0.5-1.5ml管 15%40%体积时;试管30% 体积以下，
水浴
提前10-30分钟调好温度;稳定 后才能使用;
水位不可以低于水浴锅高度 的50% 用合适浮子; 定时; 使用后需要添水或换水 关闭电源
离心
离心前，如果需要预冷，至少预冷15分 钟。盖好管盖，充分混匀； 质量对称放置； 不合适的离心管应外套其他型号的管子； 如离心0.2管，最好是放在0.5管套1.5管中； 如短暂离心可以放在1.5管中； 盖上离心机的内盖 离心后，如果要移动，放在试管架上移 动，防止破坏液面； 短暂离心要在3000-8000rpm范围内；时 间应短于30秒； 如果离心机被有机试剂或其它样品污染 当事人应及时清理
2、Quantity One 软件
是The Discovery Series 软件家族的成员，它是一 个功能强大的灵活软件包，可成像和分析一维电 泳凝胶、斑点印迹、狭线 印迹和菌落计数。 Quantity One 软件能定量和分析多种数据，包括从 光密 度仪、储能磷屏成像仪、荧光成像仪和凝胶 成像系统采集的放射性、化学 发光、荧光和染色 等样品。Quantity One提供自动分析功能以快速获 取高 质量结果。
3、注意事项
1 开关仓门时防止将EB沾在仓门盖上; 2 透射板紫外灯寿命有限，调整图象后及时 成像； 3 凝胶应及时清理，防止凝胶固化后贴附在 透射板上，造成成像不清晰； 4 成像结束后插掉透射板上水迹，防止仪器 内部生锈引起短路。
上清用等体积酚抽提1次， 12000 rpm离心 10min，小心地吸取上清。 上清再用等体积的酚：氯仿抽提1次， 12000 rpm离心10min，收集上清。 上清再用等体积的氯仿抽提1次，收集上清。 上清中加入等体积TE（稀释调整NaCl浓 度），0.6倍体积异丙醇沉淀，12000 rpm离 心10min，70%乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后 溶于100ul TER中，取1ul电泳检测，其余的20℃保存备用。
加样
加用任何试剂前要将试剂混合（除饱和酚， 或一些特别的有机试剂） 加样的枪头应在试剂的中间表层吸收，防 止枪头外壁带用过多试剂，改变加样实际 体积（除饱和酚外，一定要伸到tris饱和液 下的酚中） 加样酶（冰上）时，应注意体积准确，及 外壁不带，内壁吹打干净，注意用枪头从 反应体系的管底吸上，反复吹打
植物总（核）DNA样品
应呈现一条迁移率很小
的整齐条带。
质粒DNA的存在形式有3种： ① 共价闭环DNA（cccDNA）， 常以超螺旋形式存在； ② 开环DNA（ocDNA），此种 质粒DNA的两条链中有一条 发生一处或多处断裂，因此 可以自由旋转从而消除张力， 形成松弛的环状分子； ③ 线状DNA，因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成。 因此质粒DNA电泳的结果中 有可能出现三条泳带，它们 的泳动速度为：cccDNA > 线 状DNA > ocDNA。