4.3酵母细胞的固定化

• 【比较】酶和细胞的固定方法和特点
固定对象 适宜固定 法 特 点 酶 化学结合法、物理吸附法 体积小，固定一种酶。 包埋法容易丢失 细胞 包埋法 体积大，固定一系 列酶。 难以化学结合和物 理吸附
• 将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连 续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白 质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。
3．发酵操作
酵母细胞的活化 配制CaCl2溶液 配制海藻酸钠溶液
将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合
酒精发酵
冲洗凝胶珠
固定化酵母细胞
直接使用酶Leabharlann 固定化酶固定化细胞
酶的种数
制作方法 是否需要 营养物质 催化反应 反应底物
一种或几种
一种
化学结合法、 物理吸附法
一系列酶
包埋法 是 一系列 小分子物质
否
否
单一或多种 单一 各种物质(大 各种物质(大 分子、小分 分子、小分 子) 子)
（4）操作上的失误会导至实验结果的不同
• 酵母细胞活化 → 配制CaCl2溶液 → 配制海藻酸钠溶液 → 海藻酸钠溶液与酵母细胞混合→ 固定化酵母细胞 • 1、图中酵母菌活化就是 让酵母菌恢复正常生活 状态。 活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化 体积增大较多 时 。 • 工业化生产中，细胞的固定化要在严格 无菌 的条件 下进行。 • 2、影响此实验成败的关键步骤 配制海藻酸钠溶液 是 。此步的操作 应采用 小火间断加热 。 • 3、CaCl2溶液在形成凝胶珠时的作用原理 是 海藻酸钠胶体在CaCl2电解质作用下发生聚沉， 。 形成凝胶珠
2.固定化酶的反应柱示意图
（二）固定化细胞技术
1.将酶或细胞固定化的方法
将酶（或细胞）包埋在 细微网格里 将酶（或细胞）相 互连接起来 化学结合法 物理吸附法 将酶（或细胞）吸附在 载体表面上
包埋法
固定化酶和固定化细胞
• 3．固定化酶和固定化细胞是利用 物理 或 化学 方 法将酶或细胞固定在一定空间内的技术， • 包括化学结合法 物理吸附法 和 包埋 、 法。 • 一般来说，酶更适合采用 • 化学结合法 和 物理吸附 法固定，而细胞多采用包埋 法固定化。这是因为细胞个大，而酶分子很小； 个大的难以被 吸附 或 结合 ，而个小的酶容 易从 包埋材料 中漏出。 • 4．包埋法固定化细胞即将微生物细胞包埋在不 溶于水的中的载体。 • 常用的载体有 明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺 等。
录像
注意下列问题。
• （一）酵母细胞的活化。在缺水的状态下，微生物会处于休眠状 态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。 酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.5～1 h，此外，酵 母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容 器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。 • （二）加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验 的成败。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸 钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠 所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。 • （三）刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形 成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，一是用镊子夹起一 个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有 液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打 凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功 的。可以通过观察凝胶珠的颜色和形状来判断：如果制作的凝胶 珠颜色过浅、呈白色，说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细 胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，则说明海藻 酸钠的浓度偏高，制作失败，需要再作尝试。
酶
优点：催化效率高，低耗能、低污染，大规模地应 用于食品、化工等各个领域。 实际问题：对环境条件非常敏感，容易失活；溶 液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成 本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。 设想：将酶固定在不溶于水的载体上。
固 定 化酶
优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离， 同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。 实际问题：一种酶只能催化一种化学反应，而 在生产实践中，很多产物的形成都是通过一系列的 酶促反应才能得到的。
直接使用酶
固定化酶
固定化细胞
①对环境条件非常敏感, 反应物不易与 易失活 不利于催化一系 酶接触,尤其是 缺点 ②难回收,成本高,影响 列的酶促反应 大分子物质,反 产品质量 应效率下降 ①既能与反应物 催化效率高、耗能低、 接触,又能与产物 成本低、操作 优点 低污染 分离;②可以反复 容易 利用
海藻酸钠胶体在CaCl2电解质作用下发生聚 沉，形成凝胶珠.
• （4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合： • 将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅 拌后吸入到注射器中。 • 〖思考5〗为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？ • 防止高温杀死酵母细胞。 • （5）固定化酵母细胞： • 以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成 凝胶珠。 • 2．用固定化酵母细胞发酵 • （6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗2～3次。 • （7）发酵：150mL10％葡萄糖＋固定化酵母细胞→200mL锤形瓶 →密封→25℃发酵24h。 • 〖思考6〗发酵过程中锥形瓶为什么要密封？ • 酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。 • 〖思考7〗锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？ • 酵母菌进行无氧呼吸产生的。
固定化 细胞
设想：酶是由细胞合成的，能否将合成酶的 细胞直接固定。
优点：成本低，操作更容易。 缺点：固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可 能导致反应效果下降等。
包埋法固定细胞
• 即将微生物细胞包埋在不溶于水的多孔性 载体中，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋 酸纤维素和聚丙烯酰胺等
2．实验设计
• 1．制备固定化酵母细胞 • （1）酵母细胞的活化： • 1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h， 使之活化。 • 〖思考3〗活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复 正常生活状态的过程。 • （2）配制CaCl2溶液： • 0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。 • （3）配制海藻酸钠溶液： • 0.7g海藻酸＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯小火（或间断） 加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。 • 〖思考4〗微火加热并不断搅拌的目的是什么？ • 防止海藻酸钠焦糊。
酵母细胞的固定化
在应用酶的过程中，人们发现了一些实际问题： 酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件 非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收， 提高了生产成本，也可能影响产品质量。
1．固定化酶的应用实例――生产高果糖浆
• 1．高果糖浆的生产需要使用 葡萄糖异构酶 ，它能将葡萄糖转 化成果糖。这种酶的 稳定性 好，可以持续发挥作用。但是， 酶溶解于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的 浪费。 • 2．使用固定化酶技术，将这种酶固定在一种 颗粒状 载体上 上，再将这些酶颗粒装到一个 反应柱 内，柱子底端装上分布 着许多小孔的 筛板 。酶颗粒无法通过筛板的小孔，而反应溶 液却可以自由出入。生产过程中，将葡萄糖溶液从反应柱的 上端注入，使葡萄糖溶液流过反应柱，与 固定化葡萄糖异构酶 接触，转化成果糖，从反应柱的下端流出。反应柱能连续使 用 半 年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 葡萄糖异构酶 葡萄糖 果糖