野生型KRAS2基因对结肠癌细胞的抑制效应和其在结肠癌中杂合性缺失的研究

Ａ

Ｂ

图３变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图箭头所示为等位基因丢失

＾Ｄ１２ｓ３１０位点在正常组织及癌旁组织均为杂合型，癌组织发生等位基因丢失。

Ｂ基因型的半定量分析１０—ｌ癌组织，ｌｏ－２癌旁组织，１０一３正常粘膜组织。

４、１２ｐ１２—１３区域ＬＯＨ发生频率与ｌ临床特征之间相关分析

利用拟然比ｘ２检验比较ＬｏＨ与临床病理参数之间的关系，得出ＬｏＨ与患者年

龄、性别、肿瘤大小、淋巴结有无转移均无关（表４）。

表４１２ｐ１２—１３区域ＬＯＨ与临床病理参数的关系

合计

比例Ｐ值

组织分类癌旁组织３７１０３０％癌组织６

４

ｌＯ

６０％

年龄（岁）

≤５０４３７７０％＞５０

２

ｌ

３

３０％

性别男

５２７７０％女

１

２

３

３０％

肿瘤大小（ｃｍ）

＜５３ｌ４４０％≥５

３

３

６

６０％

淋巴结转移有

４

２

６

６０％

Ｏ．１７７５３

Ｏ．７７８１６

Ｏ．２５９７９

０．４２９１９

Ｏ．５９８１６

垂！！

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细胞数为５×１０６／ｍｌ，１０００ｒｐｍ离心５分钟，弃去培养液；

（２）ＰＢｓ洗涤，１０００ｒｐｍ离心５分钟，弃去ＰＢｓ。该步骤重复３次；

（３）加入１００ｕ１冰乙醇固定，一２０℃过夜；

（４）１０００ｒｐｍ离心，弃去冰乙醇；

（５）加ｌＯｇ几ＲＮａｓｅ酶２００ｕｌ，３７℃水浴３０分钟；

（６）加ＰＩ染色３０分钟后，在流式细胞仪测定细胞的荧光强度，数据经计算机软件分析，得出样本群体在细胞周期各个时相的比例分布和细胞凋亡的百分率。

结果

ｌ、ＫＲＡｓ２基因ＰｃＲ扩增产物

ＰｃＲ扩增ＫＲＡｓ２ｃＤＮＡ，得到５６７ｂｐ大小的扩增产物（图３）。

２０００ｂｐ

１０００ｂｐ

７５０ｂｐ

５００ｂｐ

２５０ｂｐ

１００ｂｐ

ＡＢ

图３ＰｃＲ扩增产物琼脂糖电泳图

ＡＫＲＡＳ２基因ＢＤＮＡｌＩａｒｋｅｒ２０００

２、中介重组体ＰｃＲ产物克隆和酶切鉴定

从Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５Ｑ菌株中提取中介重组体ｐＧＥＭ＿Ｔ—Ｋｒａｓ２质粒，经过ＰｃＲ鉴定示４、５克隆为阳性克隆（图４）。阳性质粒用Ｓａｌｌ酶切鉴定，酶切产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳，结果显示载体和插入的ＫＲＡｓ２片段（图５）。

１２３４５６

图４中介重组体ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｉ【ｒａｓ２ＰｃＲ结果

Ｌ∞ｅ４、５：ＰｃＲ阳性条带Ｌａｎｅ１、２、６：阴性结果Ｌａｎｅ３：ｌｌａｒｋｅｒ２０００

ｐＧ肼－ＴＶｅｃｔｏｒ

１００ｂｐ

２５０ｈｐ

５００ｂＤ

７５０ｂｐ

１０００ｂＤ

２０００ｂｐ

ＡＢ

图５中介重组体ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｉ（ｒａｓ２酶切鉴定图

Ａ酶切鉴定图（３．Ｏｋｂ，５６７ｂｐ）ＢＤＮＡＭａｒｋｅｒ２０００

３、中介重组体ｐＧＥＭ—Ｔ—Ｋｒａｓ２ＤＮＡ序列分析

将测序的结果用Ｂ１ａｓｔｅｎ程序在ＮＲ数据库中进行检索和分析，结果证实：插入的ＫＲＡＳ２基因无任何突变（附录１）。

４、真核表达重组体ｐｃＩ—ｎｅｏ—ｌ（ｒａｓ２ＰｃＲ产物克隆和酶切鉴定

根据ＫＲＡＳ２基因的限制性酶切图谱和真核细胞表达载体ｐｃＩ—ｎｅｏ的多接头酶切位点，选用Ｍ１ｕ１和ｓａｌｌ双酶分别消化ＫＲＡｓ２基因和ｐｃＩ—ｎｅｏ载体，连接转化后，构建ｐｃＩ—ｎｅｏ—Ｋｒａｓ２重组体。将该重组体质粒扩增、抽提和纯化后，经过ＰｃＲ鉴定示１、２、３、６、８克隆为阳性克隆（图６）。阳性质粒用Ｍｌｕｌ，Ｓａｌｌ双酶消化鉴定，得到５．４ｋｂ和５６７ｂｐ大小的片断（图７）。

１２３４５６７８

图６真核表达重组体ｐｃＩ—ｎｅｏ—Ｋｒａｓ２ＰｃＲ结果

ＬａＩｌｅｌ、２、３、６、８；ＰｃＲ阳性条带Ｌ∞ｅ４、７：阴性结果

１Ｚ３４５

图７真核表达重组体ｐｃＩ—ｎｅｏ—Ｋｒａｓ２酶切鉴定图

Ｌ∞ｅ３：阳性克隆Ｌ∞ｅ１、４：阴性结果Ｌａｎｅ２：空载体ｐｃＩ－Ｉｌｅｏ５、真核表达重组体ｐｃＩ—ｎｅｏ—Ｋｒａｓ２ＤＮＡ序列分析

将测序的结果用Ｂ１ａｓｔｅｎ程序在ＮＲ数据库中进行检索和分析，结果证实：包括起始密码子和终止密码子的ＫＲＡｓ２ｃＤＮＡ片段正向插入真核表达载体ｐｃＩ—ｎｅｏ，ＫＲＡｓ２基因无任何突变，表明真核表达重组体ｐｃＩ—ｎｅｏ—Ｉ（ｒａｓ２已成功构建（附录２）。

６、结肠癌细胞株Ｃａｃｏ一２细胞总ＲＮＡ的质量

ＲＮＡ样品（约１ｕｇ）用２．２％甲醛变性凝胶电泳１小时后，于紫外透射

仪下观察，可见清楚的２８ｓ、１８Ｓ和５ｓ条带，且２８Ｓ的吸光度约为１８Ｓ的两倍，表明ＲＮＡ完整性好，无降解现象。样品的０Ｄ２６０／０Ｄ２８０＝１．９３１，表明样品纯度高（图８）。

图８结肠癌细胞株Ｃａｃｏ一２细胞总ＲＮＡ表达

７、结肠癌细胞株Ｃａｃｏ一２ＫＲＡｓ２ｍＲＮＡ转录水平

以ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ为内参照，ＮｏｒｔｈｅｒｎＢ１０ｔ测定结果证实结肠癌细胞株Ｃａｃｏ一２ＫＲＡｓ２ｍＲＮＡ表达处于极低水平。该结果与ＡＴＣＣ公司提供的信息一致（图９）。

图９Ｃａｃｏ－２细胞ＫＲＡＳ２基因ｍＲＮＡ表达

８、Ｇ４１８筛选浓度的确立

将ｃａｃｏ．２细胞接种到６孔板中，待细胞的密度达５０％时，分别加入不同浓度的Ｇ４１８溶液，观察细胞生长情况。结果表明：第１０天，Ｇ４１８浓度为１１００ｕｇ／ｍ１、１２００ｕｇ／ｍｌ、１３００ｕｇ／ｍ１的孔中细胞死亡率分别是５０％、７０％、９０％：第１２天，相应的孔中细胞死亡率分别是６０％、９０％、１００％；第１４天，相应的孔中细胞死亡率分别是８０％、１００９６、１００％；根据以杀死全部细胞的最小剂量