黄嘌呤氧化酶与肝病关系的探讨

黄嘌呤氧化酶与肝病关系的探讨
赵远红邵凤珍
天津中医学院第一附属医院肝胆科（天津，!""#$!）
以往有关肝脏功能的临床分析主要集中在%&’、%(’、
&)*等一些酶的测定，近年来一些临床与实验研究表明，黄嘌呤氧化酶活力的变化与肝脏疾病的发生有着密切的关系，现就近年来有关文献报道作一概述。

#基础研究
黄嘌呤氧化酶（+,）是体内核酸代谢中一种重要的酶，
该酶由两个分子量为#-""""的亚基组成，每个亚基含有#个
钼原子，#个黄素腺嘌呤二核苷酸（.%)）和-个硫化物。

其
广泛分布于人体心、肺、肝脏、小肠粘膜等组织细胞浆膜内，血清中的+,主要来自于肝细胞［#，/］。

研究证实，通常情况下，此酶的$"0以黄嘌呤脱氢酶（)型）的形式存在，它是+,的前体，相对无活性。

但当组织处于缺血缺氧等病理情况下，就可以转化为该酶的另一种形式+,（,型），使活性大大提高并催化组织中由于缺氧不能进一步代谢和分解而积聚的黄嘌呤氧化反应，从而产生大量的自由基。

自由基被认为是组织损伤的主要分子机制之一［!］。

有动物及临床研究证实［-!1］：钙超负荷是肝缺血再灌注的重要始动因素之一。

肝缺血再灌注的发生发展与+,活性的增强及其引发的脂质过氧化反应密切相关。

同时得出：钙通道阻滞剂对肝缺血再灌注的防护作用是通过抑制+,活性、并非激活超氧化物歧化酶活性，从而降低氧自由基、减轻脂质过氧化反应而实现；钙通道阻滞剂具有保护血管内皮细胞及抑制内皮素合成的作用并拮抗其生物学效应，从而减轻肝缺血再灌注损伤。

缺血前使用维拉帕米可有效地阻止缺血期23离子内流，抑制黄嘌呤脱氢酶向+,转化，减少再灌注时氧自由基的产生即减轻脂质过氧化反应；在一定的程度上可解除氧自由基抑制，从而减轻氧自由基对线粒体电子传递链的损害，保护肝细胞的能量代谢；抑制肝缺血再灌注时血栓素%/的释放，改善血栓素%/与前列环素之间的平衡，扩张血管，从而改善肝缺血再灌液早期的微循环障碍，遏制“无复流现象”，改善肝细胞能量代谢，发挥抗肝缺血再灌注作用［4］。

异丙酚［5］、川芎嗪［1］均可有效减弱+,的活性，从而降低氧自由基水平，减轻它及其引发的脂质过氧化反应对肝脏造成的损伤；同时也能增加体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物活性，清除氧自由基，进而降低肝组织脂质过氧化程度，有效防止肝缺血／再灌注损伤。

异丙酚也直接参与自由基反应，生成/，5二异丙基苯氧基团，使自由基灭活［5］。

而川芎嗪还可抑制肝组织中性粒细胞的浸润，保护肝窦内皮并逆转其功能紊乱，抑制肝缺血再灌注损伤时循环血中血小
板的黏附、聚集及调节血栓素%/与前列环素之间的平衡，同时遏制“无复流现象”，改善肝细胞能量代谢［1］。

试验研究发现，阿拓莫兰［6］是一种广泛存在于人体内的重要内源性生物活性分子，它可维持细胞的正常代谢及细胞膜的完整性，参与多种化学物质和其代谢产物（如自由基、过氧化脂质）结合，中和、清除氧自由基，使肝细胞免受损害，而+,、%&’、%(’等酶活性的监测是重要敏感指标。

在探讨肝硬化门脉高压肠粘膜屏障损伤机制中［$］了解到：肝硬化门脉高压时，肠组织氧化系统被激活，抗氧化系统受抑制，氧自由基大量生成而清除减少，其肠组织中氧自由基水平增高，引起脂质过氧反应，导致肠粘膜屏障的损害，进一步引起细菌移位率升高。

肝硬化时肠粘膜的间隙性低灌流和正常组织氧化作用，特别肠粘膜具有高代谢与绒毛微血管结构的特点，对血流的灌流不足特别敏感，当间歇性低氧和充氧持续存在时，上皮细胞中黄嘌呤脱氢酶（)型）迅速转化为+,（,型），再灌注时分子氧重新进入缺血组织，（,型）催化次黄嘌呤分解为黄嘌呤，并进一步分解为尿酸，从中生成氧自由基。

别嘌呤醇有明显保护肠粘膜屏障的作用，它有效的降低氧自由基生成，减少肠粘膜上皮细胞脂质过氧化反应。

次黄嘌呤［#"］是一磷酸腺苷的分解代谢产物，它是一个潜在的氧自由基发生器，可以介导再灌注阶段的组织损伤。

即缺血缺氧是再灌注损伤的始动点，当氧张力下降，能量不足引起细胞内高钙，促使（)型）转变为（,型）的同时，次黄嘌呤在分子氧参与下被+,氧化为尿酸时，就形成了超氧阴离子的自由基，因此在缺氧后复氧再灌注时，+,的两种底物分子氧与次黄嘌呤急剧增长，导致自由基大量产生，参与疾病的发生过程。

研究还显示肝脏受门静脉和肝动脉双重血供，肝脏缺血时间的延长必将导致细胞的缺氧，随着肝动脉缺血时间的延长，+,活性明显降低，脂质过氧化物生成明显增加，说明肝缺血的时间越长，肝组织内氧自由基增加愈明显，对肝组织的损伤也越重［##］。

有学者［#/］取()雄鼠制成出血性休克模型［放血致血压（-47!）88*9］，实验研究观察血小板活化因子（:%’）、+,、反应性氧化剂、肝氧化剂应激和肝内白细胞聚集之间的作用。

发现实验头5个小时由+,、氧化剂应激、:%’受体激活所生成的反应性氧化代谢产物与肝内白细胞聚集在病因学上呈直线相关，白细胞聚集/-小时所见的中心小叶肝细胞损伤程度也相关，而后者是缺血性肝炎的特征性表现。

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・中西医结合肝病杂志/""4年第#4卷第!期
研究非蛋白质营养物对小鼠!"活性的影响［#$］证实：高浓度葡萄糖在增加糖利用的同时，通过影响小鼠肝脏!"的活性而影响核酸代谢。

评价海藻、甘草及其相配伍后的水提取物对肝脏毒性的影响测定肝灌流液中逸出的!"作为首选指标［#%］。

用小鼠做实验观察感染旋毛虫后小鼠肝脏氧自由基的变化，结果也发现，感染早期，肝脏的!"明显高于正常，从而显示!"似可以作为旋毛虫感染时肝脏病理变化的一个有价值的检测指标［#&］。

’临床研究
以血清!"动力学测定法探讨!"在肝胆疾病的诊治意义，结论：血清!"测定对肝细胞具有特异性诊断意义，这一点优于肝功能检测的其他酶类如()*等。

肝细胞损伤时，血清中的!"活性呈不同程度的升高，而肝外疾病如阻塞性黄疸患者!"活性多为正常，故对黄疸肝炎与阻塞性黄疸有鉴别诊断意义［#+］。

按,-*比色法测定外周血及门静脉血内毒素水平及血清、肝脏中!"等活性，结果显示：在急性腹膜炎时内毒素血症主要来源于门脉系统；外周血及肝匀浆中与产生自由基有关的!"活性均显著升高，而具有清除自由基作用的还原性谷胱甘肽的活性则明显降低。

提示：大肠杆菌诱发腹膜炎内毒素血症时伴随着氧自由基形成过多和清除能力下降的双重变化，诱导膜脂质过氧化可能是内毒素引起肝细胞损伤的重要起始环节，因此当机体发生细菌性腹膜炎时，如能及早选择合适的治疗措施，防止内毒素血症的出现，减少脂质过氧化物的生成或清除，则在阻止病情恶化、促进疾病恢复方面会起到重要的防治作用［#.］。

采用四唑盐比色法对/+例急性肝炎、慢性肝炎和肝硬化患者血清!"进行测定，结果表明$种肝病患者血清!"与参考组相比均有显著性差异，!"可作为一个反映肝细胞损伤的参考指标，对急、慢性肝炎、肝硬化患者诊断都有一定的临床意义［’］。

采用0*1／201比色法选择#%3例肝病患者（其中急性肝炎&.例、慢性活动型肝炎$$例、慢性迁延性肝炎’%例、肝炎后肝硬化#3例、原发性肝癌#+例）与正常对照组%’例在校大学生，测定血清!"，并跟踪观察，发现：除原发性肝癌组外，各组肝病患者血清!"活性均明显高于对照组（!!
454&），尤以急性肝炎最著，同时发现随着肝炎病情的稳定和恢复，!"活性也逐渐降低，而原发性肝癌患者肝细胞膜损伤
相对较少，!"活性上升也较少，提示!"活性检测可作为肝炎病情活动和疗效的观察指标［#3］。

目前的检测方法有血清!"动力学测定法［#+］：即改良的
6789:法，规定以黄嘌呤为基质、磷酸盐缓冲液;6为3、高浓度乙醇存在、温度$.<、依据$%49=波长吸光度的增高来测定，适用于全自动生化分析仪。

四唑盐比色法［’］：以血清!"与底物黄嘌呤作用，$.<孵育#&分钟后加显色剂生成紫红色化合物，在波长&$49=比色测定。

具有良好重复性的血清!"的临床检测法0*1／20*比色测定法［#/］：用黄嘌呤作为底物，酶促反应中生成的超氧离子将0*1还原成橙色的水溶液，利用其%/4!&349=间平坦的吸收峰实现测定，因对分光光度计的要求较低故适宜推广在普通实验室，使!"的检测成为常规。

$展望
!"是一种非特异性需氧脱氢酶，是体内核酸代谢中一个重要的酶。

随着近年来人们对自由基的关注，!"也作为一个敏感的缺氧缺血指标被论证，被应用。

血清!"主要来自肝脏胞浆中，当肝细胞膜受损时，血清!"释入循环，使其活性不同程度的升高，因此!"的检测将成为反映肝细胞的缺血缺氧及能量代谢状态的一个敏感指标，甚至优于()*、
>"*、)?6等酶的测定。

相信随着简易可靠的临床检测法逐渐推广使用，!"会越来越多的应用于临床与科研。

参考文献
#王冬梅，张云春，赵达5正常大鼠肝脏制脂质过氧化及肝细胞膜流动性和,@A B A(*2酶活性5大连医科大学学报，#//3，’4（$）：
’%!’.
’刘洪春，刘新增，王诗瑾5三种肝病患者血清黄嘌呤氧化酶的变化5河南医科大学学报，#//3，$$（#）：3#!3$
$秦尤文，杨伟宗5黄嘌呤脱氢酶研究进展5国外医学临床生物化学与检验学分册5’44’，’$（%）：’#3!’#/，’’’
%王万霖，林丽娜，徐正5钙通道阻止剂抗肝缺血A再灌注损伤作用机制的实验研究5中国临床药理学与治疗学杂志，#///，%（#）：
$$!$&
&王万铁，徐正介，林丽娜，等5维拉帕米抗肝缺血再灌注损伤作用的实验研究5中国急救医学，#///，#/（#4）：&/’!&/%
+林丽娜，王万铁，李东，等5异丙酚对肝缺血／再灌注时黄嘌呤氧化酶活性的影响5中国急救医学，’44$，’$（#4）：+.3!+./
.王万铁，林丽娜，王为，等5川芎嗪对肝缺血再灌注损伤时黄嘌呤氧化酶活性的影响5中国中西医结合急救杂志，’44$，#4（+）：
$%4!$%’
3郝云龙，闻勤生5阿拓莫兰对缺血再灌注损伤肝脏的保护作用5中国急救医学，’44’，’’（&）：’.%!’.&
/唐银河，刘志苏，艾中立5氧自由基在肝硬化门脉高压大鼠肠粘膜屏障损伤中的作用及别嘌呤醇的保护作用5医学新知杂志，
’44#，##（$）：#’$!#’.
#4张玉琴5次黄嘌呤与自由基5国外医学妇幼保健分册5#//&，&（’）：.4!.’
##向国安，黎一鸣，秦兆寅，等5肝动脉缺血供肝组织氧自由基含量变化的意义与防治5陕西医学杂志，#//+，’&（#4）：+$%!
+$+
#’C@=@D@E@，C(99F在休克／复苏后肝损害中由黄嘌呤氧化酶和白细胞生成的血小板活化因子和反应性氧化剂的相互作用5国外医学外科学分册，’444，’$（$）：$3.!$/3
#$卢大用，王三忠，沈启华5非蛋白质营养物对小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶的影响5上海科技大学学报，#//’，#&（’）：#4#!#4&
#%丁选胜，李欧5海藻甘草及其相配伍后的水提取物的肝毒性研究5江苏中医药，’44’，’$（#4）：&#!&%
#&程晓馨，崔煜，王莹，等5感染旋毛虫小鼠肝脏氧自由基的变化
・
/
3
#
・
中西医结合肝病杂志’44&年第#&卷第$期
大连医科大学学报，!""#，!$（%）："$!!&&
!#张一兵，张淑芹，徐刚，等’黄嘌呤氧化酶动力学法测定及对肝病的诊断意义’中国实验诊断学，%&&%，#（(）：!)$!!)"
!*王玉琨，姜妙娜，高精涛’急性腹膜炎时的内毒素血症及肝脏的变化’大连医科大学学报，!""#，!$（(）：!#!!!#(!$闻平，龚玉华’黄嘌呤氧化酶和血清蛋白检测在肝病诊治中的意义’中国综合临床，%&&!，!（!）：*"
!"闻平’+,-／.+-比色法测定血清黄嘌呤氧化酶’陕西医学检验，%&&&，!/（!）：!&!!!
（收稿日期：%&&/0&%0%!编辑：彭萌）
自体骨髓干细胞移植治疗肝衰竭应用基础研究进展
曾伟导!王平%樊群%
!’深圳市布吉人民医院（广东深圳，/!$!!%）%’深圳市东湖医院
骨髓源性肝干细胞（123-4）移植作为辅助治疗急性肝功能衰竭（567）的方法，可以免除异基因或异种细胞所致的免疫排斥、传染疾病等风险，规避异体原位肝移植所带来的其他问题。

现将近几年来有关应用基础的研究综述如下。

!理论基础
%&&&年.898:;8<等［!］、,=8>;8等［%］和5?>;@<等［(］的研究相继指出，骨髓干细胞能够在鼠肝内转化成为肝卵圆细胞甚至成熟的肝细胞和胆管细胞，并证明了在接受过骨髓移植或肝移植的患者体内这种现象也同样存在。

6A B A;;8等［)］在753缺陷大鼠模型中证实，骨髓干细胞能在肝脏内分化为功能完备的肝细胞，改善753缺陷大鼠的症状，只要/&个干细胞就能达到很好的效果。

针对肝内出现的新标志细胞是植入细胞与原肝细胞的融合而不是干细胞横向分化的质疑，%&&)年发表的几篇文章，在对初始细胞状态、分化环境等严格控制的条件下，证明造血干细胞可以横向分化为肝细胞而没有细胞融合。

当造血干细胞与损伤的肝组织在分隔的体系中共培养时，损伤肝组织分泌的因子刺激了干细胞的横向分化，但由于干细胞不与肝组织直接接触而排除了融合的可能性，并在移植给肝损伤鼠后，随着肝组织损伤的增加而转化为有活性的肝细胞，肝功能在细胞移植%!*天得以恢复［/!*］。

总之，已有大量实验数据充分证实：骨髓中确实存在能分化为肝细胞的干细胞，直接将其移植到肝脏，在肝脏微环境调节下可分化为肝细胞，为多种严重肝脏疾病的治疗开辟了新的领域。

5C>9A?等［$］用肝细胞生长因子（3D7）体外诱导培养由骨髓分离出来的"%E%／,=F G!的骨髓细胞，培养后的细胞具备肝细胞表面标志5H I E><，57.，4J!$，并具备肝细胞部分功能，如能合成尿素、白蛋白。

K8:L A>??>8等［"］的实验室也报道，从大鼠、小鼠和人的骨髓中分离得到多能成年祖细胞（E I?9>M N@98<9A O I?9N:@B8<>9@:P8??;，+5.4;），该细胞体外经7D7M)和3D7诱导可分化为功能肝细胞，此细胞能合成尿素、白蛋白、糖原，具有细胞色素.)/&活性，能吸附#M低密度脂蛋白。

将
这一亚群细胞移植至肝脏，用绿色荧光蛋白和白蛋白双标技
术可证实其已经分化为功能完备的肝细胞，实验中没发现有肿瘤原性。

以色列的科学家［!&］发现，当肝脏遇到损害时，它会产生大量的信号分子来诱导骨髓干细胞转移和分化，修复受到损害的肝脏细胞，这些信号分子有3D7、基质金属蛋白酶"（++.M"）和基质细胞衍生因子（-27M!）。

骨髓干细胞一旦感知-27M!从肝脏发出的信号，会不断产生并释放出来，然后再转移到肝脏。

我国也有不少关于干细胞分化调节机制的研究论文［!!!!)］，基本证实了以上研究结论。

%细胞分离、培养和增殖
%’!细胞分离近年来，很多的试验方法可以分离人类骨髓间充质干细胞，并在体外分化成为肝干细胞。

骨髓间充质干细胞有多种特异的表面标志，如42
!!*
、42
()
、42
)/
、54
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、,=F%!等［!(，!)］。

有文献证实4!Q R N等可以作为从骨髓细胞中选择具有肝细胞分化潜能细胞的阳性标志［!/］。

目前，抗原包被法、亲和柱层析法、粘胶法、补体介导溶解法等)种方法不可避免的丢失很多干细胞，使用不多，而细胞分选法、免疫磁珠阴性选择法应用较多［!#!!$］。

免疫磁珠法分离细胞时，首先使用密度梯度离心和贴壁筛选相结合，利用.8:P@??分离液将大部分造血细胞与单个核细胞分离开来，然后经过体外贴壁培养一段时间，通过换液去除悬浮生长的造血细胞，可以获得骨髓间充质干细胞［!"］
（细胞分选法）；流式细胞仪检测荧光标记的42
()
G42($0 -P A?G表达阳性细胞纯度达（$#’/S(’%）T，细胞活力为（"/’$S%’%）T（免疫磁珠阴性选择法）。

%’%细胞分化和增殖347是目前最强的肝细胞诱导分化
剂［%&］，用高浓度的3D7、7D7
)
诱导体外培养的大鼠骨髓干细胞，R,M.4R检测到白蛋白及57.的表达，免疫细胞化学也证实了该经诱导的细胞出现了57.、白蛋白及4J$／!$等肝前体细胞的特征性表达［!$］。

-I U I V>等［%!］等报道，347可诱导白蛋白阴性的肝干细胞转变为白蛋白阳性的肝祖细胞。

此外，在/T的淤胆血清时，骨髓源性肝干细胞在此病理筛选
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!
・中西医结合肝病杂志%&&/年第!/卷第(期。