线粒体中DNA聚合酶的表达缺陷会导致小鼠过早老化

线粒体中DNA聚合酶的表达缺陷会导致小鼠过早老化
原作者：Aleksandra Trifunovic, Anna Wredenberg, Maria Falkenberg,Johannes N.Spelbrink, Anja T.Rovio, Carl E.Bruder,Mohammad Bohlooly-Y, Sebastian Gidlof, Anders Oldfors,Rolf Wibom, Jan Tornel, Howard T. Jacobs & Nils-Goran Larsson,
翻译人：朱奕彰完成日期：11月17号
学号：1110305106
一、摘要：
人类，猴子和啮齿动物的衰老过程中线粒体DNA（mtDNA）的点突变和缺失在各种组织中都有累积。

这些突变是不均衡分布的而且可以在某些细胞中克隆性积累例如心脏，骨骼肌和脑等组织并导致嵌合型呼吸链缺陷疾病，以衰老过程而言，它们可能出现的因果效应已经被广泛激烈的讨论过因为其丰度较低而且仅与衰老相关联。

我们通过建立具有表达校读缺陷的PolgA（核编码的mtDNA多聚酶催化亚单位）的纯合基因敲入小鼠实验来说明这个问题。

研究之后我们发现基因敲入小鼠形成了mtDNA突变基因型，并且其mtDNA点突变增加了3-4倍，缺失也增加不少。

这种体细胞mtDNA突变的增加与寿命减短和提早出现衰老相关的表型如体重降低，皮下脂肪减少，秃顶（脱毛发），脊柱后突（脊柱弯曲），骨质疏松，贫血，生育力下降和心脏增大相关。

我们的实验结果分析出了哺乳动物中mtDNA突变和衰老表型之间的因果关系。

二、关键词：
线粒体DNA多聚酶，表达缺陷，mtDNA突变，早衰。

三、正文：
酵母和动物细胞中的线粒体DNA聚合酶有一种内在的3’ -5 ‘外切酶活性，在合成mtDNA9 - 11的缺陷校对中起到很关键的作用，对于酿酒酵母线粒体DNA聚合酶外切酶的活性，Mip1p，是至关重要的并且依赖于在外切酶结构域残留的具体保守的三个天门冬氨酸调控，于是我们创建基因敲除小鼠（图1A- D）对线粒体DNA聚合酶进行催化改变，使得PolgA亚基含有一个丙氨酸，而代替了关键的第二次外切酶结构域（D257A）中的残留天门冬氨酸。

我们首先在胚胎干细胞（图1a）（图1b）产生了PolgA（mutNeo）基因，并获得了这种等位基因的种系传播（图1C，D）。

下一步，我们切除了PolgA 两侧的与新霉素抗性有关基因并与杂合子PolgA（mutNeo）基因小鼠交配，结果表达出了FLP –重组酶，从而产生杂合子PolgA(mut)（+/ PolgA(mut)）小鼠（图1a，C，D）。

因为别人做的实验都显示新霉素抗性基因的存在可以产生亚等位基因的形成，故我们选择对其执行体内新霉素抗性基因切除手术。

最后，我们通过其与+/ PolgA （mut）小鼠进行杂交以产生纯合子的基因敲定小鼠（PolgA（mut）
/ PolgA（mut）），以下简称记“线粒体DNA的增变基因”小鼠。

我们在体外分析了重组线粒体的DNA聚合酶全酶复合物，发现线粒体DNA聚合酶包含的PolgA亚基中的门冬酰胺突变为丙氨酸，并且此突变位于其外切酶结构域中，对外切酶的活性减少起到了深刻的影响（图1E）。

有其他证据表明，酵母中某些核酸外切酶的部分结构缺陷会减弱线粒体DNA聚合酶合成DNA的能力。

然而，生化分析与重组分析发现对于线粒体DNA聚合酶有核酸外切酶缺陷的小鼠（图1F）或提取了线粒体敲定基因的杂合子（+/ Polg（mut））小鼠或线粒体DNA上具有增变基因小鼠（图1G）来说，它们的活动中均未出现DNA聚合酶减少的现象。

那些线粒体DNA的具有增变基因的小鼠，直到发育到大约25周的年龄时才开始有正常的外观，但与此同时我们也第一次注意到其背部有轻微后凸和全身脱发现象，并发现随着小鼠的老去其后凸的程度与脱发的程度成正比（图2a）。

线粒体DNA中具有增变基因的小鼠寿命中位数为48周，并所有小鼠都在61周前死亡（图2E）。

线粒体DNA具有增变基因的小鼠一开始体重增加，并随时间变化增加速度不断变慢，而从15 - 20周的时候开始，小鼠体重开始降低（即出现负增长），也有人说是从24周开始的，这个差异与实验结果没有太大关系（图2F，G）。

在人体衰老过程中脱发是很常见，此外，体重下降这种情况对于
年龄超过60岁的老年人和年龄超过1.5年小鼠中都是有据可查的。

我们用X射线密度仪对小鼠全身的各方面指标进行定量评估（图2c）或解剖股骨骨头对其骨矿物质密度（BMD）进行了比较（图2d）。

经过测量发现，体重偏轻的小鼠其身体的各部分比例长度是正常的，而mtDNA中具有增变基因的小鼠（图2c）其脂肪含量减少，符合其整体外观（图2a）并且与皮下脂肪组织学分析结果一致（图2b）。

而在人类中，也有相似的情况，即当人们超过65岁后随着年龄的增长皮下脂肪开始出现明显减少，这是很常见的皮肤老化现象之一。

而在骨矿物质密度（BMD）的比较试验中，人们发现随着年龄的增大线粒体DNA具有增变基因的小鼠（图2c）其骨中矿物质密度（BMD）不断降低，并在40周时出现了骨质疏松症的临床特征（标记后凸;图2A）。

并且从40周开始小鼠全身骨头的矿物质含量比例（BMC）有减少的倾向（图2c）。

我们也通过分析解剖股骨，并提高BMD与BMC的测量精度，使试验更精确，结果发现线粒体DNA具有增变基因的小鼠和野生型小鼠在发育到20周时BMC 与BMD含量是几乎一致，没有多大的区别。

然而当线粒体DNA具有增变基因的小鼠在发育到40周时，其骨中矿物质密度（BMD）（图2d）与BMC 含量突然明显减少了（未显示）。

总之，X -射线密度测定揭示了随着
年龄的增大线粒体DNA具有增变基因的小鼠其身体各方面指标的改变过程以及脂肪含量的不断减少和慢慢患上了骨质疏松症等，与人类相之比较，同样发现人体衰老同样是伴随着脊柱后凸和骨质疏松症的出现。

两者是相一致的。

在老化的大多数啮齿动物中都发现存在有骨质疏松，所以就证明了野生型小鼠老化过程中出现的骨质密度下降现象。

经检验我们发现在25周时线粒体DNA具有增变基因的小鼠外周血液中血红蛋白浓度显着降低（P <0.001学生t -检验）含量约为（每升血液81±3克，分析了9只动物），与之比较野生型小鼠的含量为（每升血液106±3克，分析了8只动物）。

线粒体DNA具有增变基因的小鼠所患贫血是红细胞变形和血蛋白含量过少的结果（补充表1）。

此外，我们观察到在线粒体DNA具有增变基因的小鼠还出现有肝脏髓外造血（图3b）和脾脏肿大（补充表2和表3）等现象，并且与红髓（图3a）的增加相关。

在小鼠的衰老中均发现有脾和肝脏的造血疫源增加现象的出现。

还应当指出，病因不明的贫血也是在老年患者中常见的一个临床问题。

线粒体DNA具有增变基因的小鼠心脏重量随其体重的增加而增加（补充表3可见）。

其心脏的左心室在发育40周时出现了管腔扩大（图3c）。

而在人类老化过程中通常也发现心脏重量增加和左心室肥大等现象。

野生型小鼠衰老过程中往往会伴随一些心肌病的产生。

对此我们进行了线粒体DNA具有增变基因的小鼠心脏肌肉组织的切片酶组织化学染色，并发现了一个镶嵌型图案，应该是一些心肌细胞中细胞色素C氧化酶缺乏导致了这种图案的显现（图3d），此结果与人类衰老心脏肌肉组织的切片的结果是类似的。

根据这一发现，我们用光镜对心肌薄的部分进行了切片实验，分析结果表明一些心肌细胞之所以呈现空泡化的外观，是因为其中线粒体增大的积累所致（图3E）。

而线粒体DNA具有增变基因的小鼠心脏组织切片的电子显微镜研究也证实了心肌细胞线粒体的异常积累现象（图3F）。

经实验研究还发现，线粒体DNA具有增变基因的雌雄小鼠的生育率均大大降低，实验是
用15只线粒体DNA具有增变基因的雌性小鼠与15只野生型雄鼠进行交配，其中有14只雌鼠怀孕，每只都仅仅生下了一或两窝正常大小的幼鼠。

然而，当雌鼠年龄大于20周后，不管在几个月内与雄鼠进行多少连续不断的交配，它们始终无法怀孕了。

我们还设立了8只线粒体DNA具有增变基因的雄鼠与16只野生型雌鼠进行了几个月的交配的实验组，结果发现仅仅只获得一窝的幼鼠。

进一步的实验我们发现从12周起线粒体DNA具有增变基因的雄鼠的睾丸体积大大小于同龄野生型雄鼠（图3G;补充表2和3）。

从线粒体DNA具有增
变基因的小鼠的睾丸检查发现证实了其附睾中精子含量减少（数据未显示），并与睾丸部分的组织学分析结果相一致（图3G）。

在40周时我们观察到线粒体DNA具有增变基因的小鼠出现了严重的睾丸管变形，并且其中完全没有了精子（图3H），而在人类中，随着年龄的增长女性生育率降低，男性则睾丸中产生的每毫升精子含量下降。

野生型小鼠睾丸老化时退化的睾丸管最多占据60％的睾丸体积。

我们对线粒体DNA分子进行Southern杂交分析，发现在线粒体DNA具有增变基因的小鼠中广泛分布着一类较短的线粒体DNA分子，最长也不过12（KB）碱基长度（图4a和补充图1），为作进一步分析，我们用单一识别位点的限制性内切酶切割正常的小鼠线粒体DNA（图4a）。

限制性内切酶NaeI，EagI和BlpI没有分解较短的线粒体DNA分子，而限制性内切酶BglII，XhoI，NcoI，SACI 和AatII则分解了较短的分子，并给出了其DNA片段的模式显示，表明剪切的那部分线粒体DNA分子是呈现为线性，整体DNA分子的一个亚基（图4a），线粒体DNA被内切酶剪切的分子数量并没有改变随着时间的推移而改变，而在所有调查的组织中其线粒体DNA 酶解的程度则是可以比较的（补充图1），所以用放射性标记寡核苷酸或短的DNA片段（图1）进行Southern杂交分析，从而定位了线粒体DNA被内切酶剪切的区域位于OH和OL的小弧之间（图4b），这与限制性内切酶剪切的结果是相一致的（图4a），此外从实验结果还能看出基因敲入小鼠的线粒体DNA全长的平均水平仅为野生型小鼠的70％（图4c），但是这段减少的线粒体DNA长度并没有影响整体的mtDNA表达，其编码的细胞色素c氧化酶亚基1信使RNA（图4d）和的细胞色素c氧化酶亚基2多肽均达到了正常的稳态水平（图4E），这些结果是与我们先前的观察结果相一致，但基因敲除的杂合子（+/Tfam-）小鼠中线粒体转录因子的拷贝数普遍下降了35 -40％（与野生型相之比较）却对线粒体DNA的表达和呼吸链功能影响不大。

对大脑，心脏和肝脏等的线粒体DNA片段克隆和测序排序，发现线粒体DNA具有增变基因的小鼠其体细胞mtDNA的点突变几率增加了（3 – 5倍）（图4F）。

从PCR（聚合酶链式反应）看突变的背景是对mtDNA突变载荷时减去了其的计算值。

另外我们还舍弃了一些多次出现的单一突变，因为它们可以反映出克隆扩增现象，包括基因选择和/或遗传漂变，因此提出的体细胞线粒体的基因突变频率（图4F）仅代表一个保守的最低估算，我们结合细胞色素b基因的测序结果即所有线粒体DNA具有增变基因的小鼠在不同时间和不同组织中其中出现有0.600个别突变），并发现所有密码子的排序位置都受到了其的影响（图4G）。

此外补充一点就是说，细胞色素b基因
是在其上均匀地分布突变变异的（图4H），因此，线粒体DNA具有增变基因的小鼠其mtDNA上没有明显的突变热点，虽然突变在非编码控制区的阻力低于在细胞色素b基因上，但在杂合子小鼠的突变阻力与野生型小鼠无异（图4F），而这些小鼠显示没有表型，故表明PolgA（mut）的基因突变是隐性的。

因为研究发现在一些心肌细胞的线粒体质量有所增加（图3E，F）并且出现了细胞色素c氧化酶缺乏症（图3d），故我们进一步分析线粒体DNA具有增变基因的小鼠心脏中的呼吸链功能（图2），还发现随着线粒体质量的增加柠檬酸合成酶的活动亦有所增强，而其心脏中线粒体呼吸链酶的活动减弱导致A TP产率逐步减少（MAPR），观察到的呼吸链酶活动的下降和与MAPR相一致的不足之处均是诱发了线粒体DNA基因突变（补充图2）。

我们的研究结果建立了直接的实验将体细胞线粒体DNA的突变水平的提高，呼吸链功能障碍及其在老化哺乳动物的表型显示三者联系在了一起，线粒体DNA具有增变基因的小鼠其线粒体DNA 的突变负载增强以至产生变异型，因为它并不与杂合子或野生型小鼠共享基因。

然而，详细的体细胞mtDNA突变为啥能够积累的动力学解释仍然有待进一步研究，在小鼠发育2个月时间内，已经有大量的突变负荷积累，并不同组织之间的统一检测到，这表明绝大多数突变的积累可能在胚胎或胎儿的发育时产生，小鼠早衰的发病不随时间由一个持续6个月左右大量的一直积累的线粒体DNA突变相关，相反，它似乎更有理由归因于成年小鼠线粒体基因的高突变负荷累积和/或基因隔离或克隆扩增导致特定的突变积累造成的生理损害，实验观察到小鼠心脏中体细胞呼吸链缺乏呈镶嵌性发生为此观点提供了论证, 在重要的细胞中mtDNA的突变积累超过了一个临界值后导致细胞的损伤（例如，通过细胞凋亡或DNA复制速率减慢与氧化应激导致的端粒缩短）可能是导致表型体现为过早的老化和寿命的减少关键的一个过程，我们曾产生了一系列具有组织特异性的Tfam基因敲除小鼠品系，它们在不同的器官组织中线粒体DNA的表达均减少和有着严重的呼吸链缺乏症，并伴随着细胞死亡和/细胞凋亡，然而，我们发现在这些小鼠中对活性氧反应（ROS）只有轻微或根本就没有防御机制以应对，故在这些基因敲除小鼠中，可能有一些关联性即增加的ROS含量通过产生生理损伤从而导致线粒体DNA具有增变基因的小鼠早衰，这是不容忽视，不同于组织特异性Tfam小鼠对以上的影响，其对呼吸作用和氧化磷酸化的影响基本上是一个定量，线粒体DNA 具有增变基因小鼠的创建显然是通过随机设置呼吸链亚基上基因的点突变而产生的，从前列出的定性可以预料到，如定量一样，那些异常，如ROS的产生增加异常和质子泄漏是可能的后果，因此，对未
来的实验探究即体细胞增加的mtDNA突变是否可以在遗传过程中而抵消，怎样的药物或饮食干预可以影响ROS的形成，生物能的动态平衡，细胞死亡，细胞凋亡以及其他呼吸链系统的病理或生理的功能障碍，线粒体DNA具有增变基因的小鼠将是一个宝贵的实验工具，这种方法可使我们能够设计策略以对抗或延缓自然中人体衰老的体细胞发生mtDNA突变的有害作用。

四、总结：
本文对线粒体中DNA聚合酶的表达缺陷是否会导致小鼠过早老化这一问题阐述的相当详细，通过设立线粒体DNA具有增变基因小鼠的实验组，对其体重，皮下脂肪，秃顶（脱毛发），脊柱后突（脊柱弯曲）和心脏大小等形态组织学问题进行了多组实验（组织学分析），并与野生型小鼠比较，和对其骨质疏松，贫血，生育力较弱等一些病症也通过实验来比对验证原因（病理学分析），以及对线粒体DNA上的点突变发生频率的分析（分子遗传学分析），此外，还有Southern杂交手法进行基因定位，分析基因与线粒体DNA表达及呼吸链作用的关系，最终作者通过这么多严谨周密的实验分析十分有力的证明了论题：即线粒体中DNA聚合酶的表达缺陷的确会导致小鼠过早老化。

五、翻译感想：
这是我第一次翻译的生物论文，所用词语难免有些青涩，不当之处敬请谅解，我大致用了20多个小时，将本文中的每个生词查了一遍后又一句一句的翻译，并结合自己所学知识对其进行了一些分析，整合语序，替换了一些不适当的词，最后完成翻译。

翻译过程中很辛苦也很头疼，有时会因为一两个词而纠结个半天，但是翻译完这样一篇完整的论文之后，我感觉是十分值得的，首先，终究我们以后也要写论文，其中不乏有英文论文，这样在大一时期就接触论文可以让我们提前适应这一过程，到我们写时就不会那么的迷茫，这十分有利于我们今后的论文写作；其二，翻译过程中接触了那么多的新词，对我们的英语水平有了更高的要求，从而也大大的提高了我们的翻译水平，并激励了我们学习英语；其三，翻译完这样完整的一篇生物论文后，极大程度上的培养了我们对生物学习的兴趣，我打算找Science上一篇与癌症基因治疗有关的论文接着进行翻译；此外，读了这篇论文后，我还发现就本论文的实验过程超过5年，实验早在一九九几年就开始做，而论文最终是2004年发表在Nature 上，可见发表一篇论文的艰辛，这可以说是让我体现了解到我以后的艰辛了吧。

在本次翻译过程中，我也深刻的体会到了自己英语词汇量太小还有生物知识的不够扎实等诸多问题，虽说自己是生物竞赛报送的，
但是还是有很多的知识自己不太懂，故在今后的学习里，我将用好课堂的每一分钟，记好笔记，扎扎实实看书，并且我相信凭借我对生物学习强烈的兴趣，以后我也能写出这样的论文。

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