环指蛋白43的结构、功能及其在肿瘤中的作用

环指蛋白43的结构、功能及其在肿瘤中的作用
徐星宇;来茂德
【摘要】环指蛋白43(ring finger protein 43,RNF43)是Wnt信号通路中重要的负向调控因子之一.RNF43的异常表达、突变等改变与肿瘤的发生、发展密切相关,在临床上具有较为重要的意义.该文对RNF43的结构、功能及各项研究进展作一概述,描述其在肿瘤发生、发展进程中的作用.
【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》
【年(卷),期】2016(032)006
【总页数】5页(P673-677)
【关键词】肿瘤;Wnt信号通路;RNF43;文献综述
【作者】徐星宇;来茂德
【作者单位】浙江大学医学院病理学与病理生理学系,杭州310058;浙江大学医学院病理学与病理生理学系,杭州310058
【正文语种】中文
【中图分类】R73
环指蛋白43(ring finger protein 43, RNF43)基因定位于人类常染色体17q22，其编码的蛋白为一种E3泛素化激酶。

RNF43由于与ZNRF3(zinc and ring finger 3)结构上高度同源而共同在Wnt信号通路相关研究中受到关注。

RNF43在Wnt通路中的功能认识主要立足于RNF43的E3泛素-蛋白连接酶活性[1]，总体上支持RNF43具有负向调控Wnt信号强度的功能。

但RNF43在肿瘤发展中发挥
促癌还是抑癌--------------------
来茂德，男，教授，通讯作者。

E-mail:***********.cn
作用不同文献研究结果尚存争议。

文献报道RNF43有许多突变位点，但对这些突变的确切作用未进行深入研究。

该文对RNF43的结构、功能以及在肿瘤中的作用作一概述。

RNF43基因编码的蛋白全长783个氨基酸，推定分子相对质量为9.0×104。

RNF43肽链的1～55位组成信号肽，56～219位组成胞外拓扑域，跨膜结构域由220～240位氨基酸组成，锌指模体由293～334位氨基酸组成，335～783位氨基酸组成胞内拓扑域，C端存在核定位信号肽[2]。

RNF43具有泛素-蛋白连接酶活性。

RNF43可能的底物包括Wnt通路受体复合物[3,4]。

p53蛋白也是一种可能的底物[5,6]。

RNF43在信号通路中的关系模式图如图1所示。

2.1 RNF43在Wnt信号通路中的功能Wnt通路异常激活在肿瘤进展中有重要作用，许多研究结果提示RNF43在肿瘤进展中的作用主要是通过抑制Wnt通路实现。

早期研究认为RNF43在Wnt信号通路中处于上游始动环节。

这一时期对RNF43的关注多是基于RNF43与ZNRF3的结构同源性，多着眼于二者的E3泛素化连接酶活性对Wnt膜受体的清除导致的负向调控效应；该阶段的研究显示二者的效应存在很大相似性。

随着研究的深入，发现RNF43能通过不同机制抑制经典Wnt-β-catenin通路及非经典Wnt通路，由此受到单独的关注。

除经典的膜受体清除效应外，还发现RNF43可影响TCF4的胞内定位，从而抑制其与β-catenin 的结合[7]。

2.2 RNF43在Wnt通路上游段的效应ZNRF3/RNF43与Wnt受体复合物结合后使卷曲蛋白(frizzled, FZD)和低密度脂蛋白受体相关蛋白6(lipoprotein receptor-related protein 6, LRP6)翻转并导致其从细胞膜上清除，从而抑制Wnt
通路信号，该效应依赖于锌指模体的存在[2]。

该过程中，卷曲蛋白的胞外蛋白酶
相关(protease-associated, PA)结构域及富含半胱氨酸(cysteine-rich, CRD)结构
域与RNF43的锌指模体的相互作用是RNF43抑制经典Wnt-β-catenin通路的结构基础。

ZNRF3/RNF43通过促进卷曲蛋白与LRP6的降解实现Wnt抑制的效应
必须在与蓬乱蛋白(dishevelled, DVL)(Wnt的正向调控因子)相互作用后才能发挥，该过程中DVL通过其DEP区域(dishevelled, Egl-10 and Pleckstrin domain)介
导了RNF43与FZD的结合。

将DEP区域与ZNRF3/RNF43构建融合蛋白可以使其FZD抑制功能摆脱DVL依赖，证明该区域的决定性作用。

敲除DVL后，细胞
表面的LRP6与FZD水平显著升高[3,8]。

相关分子的相互作用情况如图2。

RNF43对非经典Wnt通路的调控与其C-端胞质区相关而与N-端基本无关。

C-端胞质区通过与蓬乱蛋白的PDZ区域互作实现调控。

RNF43的错义突变(胞外段：
I48T、L82S、R127P)使其失去与FZD的共定位，导致其卷曲蛋白依赖的Wnt抑制功能失效，但不影响其抑制非经典Wnt通路的能力[3]。

2.3 RNF43在Wnt通路下游段的效应有研究发现在一些β-catenin持续激活
的肿瘤细胞系中RNF43仍然具有抑制Wnt信号通路的效应，这提示RNF43应当具有除膜受体清除外的其他效应机制。

Loregger等[7]研究认为RNF43的该项效
应是通过与TCF4(T cell factor 4)结合后将其阻滞在核膜实现的。

在该过程中未观察到TCF4的泛素化水平改变，但RNF43的锌指模体突变及一些近C端突变将消除这种抑制效应，提示RNF43可能具有不依赖泛素化连接酶活性的其他作用机制。

RNF43与ZNRF3在结构上高度同源，功能上也有很多相似之处，也许ZNRF3在Wnt通路下游段也可能存在类似效应，并可能与RNF43存在一定交互。

对
RNF43该项效应的进一步研究也应该将ZNRF3纳入考量。

2.4 RNF43与p53通路RNF43与p53及其通路中相关重要蛋白互相作用的研究较少，多数为效应及现象描述性报道。

Shinada等[6]应用酵母双杂交法筛选后
用免疫共沉淀法发现RNF43与NEDL1(NEDD-4-like ubiquitin-protein ligase-1)存在相互作用。

他们在H1299肺腺癌细胞系中的转染实验表明，RNF43与
p53共转染后可以抑制p53的转录活性，并可以剂量依赖性地抑制由紫外线诱导的细胞凋亡效应。

NEDL1表达可促进p53介导的细胞凋亡[9]，因此RNF43的抑制凋亡效应也可能是通过p53相关通路实现的，具体方式可能是通过泛素化NEDL1或直接泛素化p53。

RNF43与p53相关性研究的问题在于未能明确找到具有关键性作用的效应分子，并在通路中直接验证其与RNF43的互相作用，至今对该现象也未能做出基于结构功能的详尽解释。

RNF43与p53的关联性强弱有待进一步细致工作来阐明。

3.1 RNF43的调控因素R-spondin 1(RSPO1)抑制RNF43/ZNRF3的Wnt效应。

RSPO1能与RNF43/ZNRF3的PA段结合并招募LGR5(leucine-rich repeat G-protein coupled receptors 5)及其家族成员LGR4/LGR6等形成LGR-RSPO1-RNF43复合物，导致RNF43/ZNRF3的膜清除，从而负向调节其Wnt通路抑制效应，体现为Wnt通路的活化[10]。

将RNF43替换为缺乏锌指模体的RNF43ΔRING蛋白后虽仍可形成三体复合物，却不再产生RNF43膜清除现象，提示该过程可能与RNF43本身的E3泛素化连接酶活性有关，在该复合物中RNF43可能居于效应分子的地位[11]。

RNF43/ZNRF3双敲除后RSPO1的Wnt 活化效应也会消失[8]，印证了这些分子在信号通路中的上、下游关系(图3)。

RNF43能够抑制Wnt信号通路，同时其表达也直接受到Wnt通路激活强度的调控，二者形成反馈环路。

RNF43的第二内含子上含有2个Wnt信号识别元件(5′-CTTTGAA-3′；5′-CTTTGAT-3′)，是TCF4/β-catenin的直接靶点。

在结肠癌细胞系中进行的核苷酸替换实验证明这两个元件对于其转录激活均是必需的[12]。

至今尚未有研究阐明这两个信号识别元件在临床样本中是否存在突变。

3.2 RNF43与ZNRF3的关联RNF43与ZNRF3结构同源性很高，现有的实验
证据表明二者的结构功能存在很大的相似性。

依据Chen等[11]的实验结果，在HEK293细胞系中ZNRF3和RNF43的分别过表达对Wnt通路的抑制效应并不相同，ZNRF3过表达可以强烈抑制Wnt通路，而RNF43过表达的该项效应远弱于ZNRF3。

RNF43转染可逆转ZNRF3敲除所导致的Wnt信号通路抑制。

CRISPR
技术构建的RNF43/ZNRF3双敲除模型相比单一敲除模型具有更为彻底的效应清
除[2]。

有理由认为RNF43及ZNRF3之间可能存在互为后备或协同等交互作用，也可能当一者产生突变影响功能时另一者能够在一定程度上发挥代偿作用。

鉴于ZNRF3和RNF43在表达谱上存在很大差异，其共同表达的部位仅有肾脏等少数
组织，这也可能是一种在机体不同的组织器官内控制Wnt信号通路激活程度的机制。

目前对RNF43的临床效应的考察中，没有研究将RNF43的同源蛋白ZNRF3同
时纳入。

这可能是现有临床研究中RNF43突变效应不一致的原因之一。

研究
RNF43的临床效应时将ZNRF3一同纳入考量具有必要性。

4.1 RNF43在正常组织及肿瘤组织中的表达RNF43的表达及分布情况在生理
与病理情况下存在较大差异，主要体现在各种肿瘤中。

正常组织中RNF43的表达水平基本处于检测限下或不表达。

RNF43在肿瘤组织
中的表达量常有较大幅度的升高，已有研究报道的有肝细胞癌、肺腺癌、结直肠癌、胰腺癌、神经胶质瘤等。

这些研究多为对福尔马林固定-石蜡包埋或新鲜肿瘤组织
中的mRNA进行提取后用PCR法检测表达量，该方法未能很好地区分RNF43具体由肿瘤组织中哪种细胞成分所表达，因此在揭示RNF43在肿瘤进展中的地位和作用方面还未真正明确。

近年来在组织切片中对RNF43的表达情况进行免疫组化检测的数据逐渐增多[7,13-15]，结果支持RNF43在大部分肿瘤组织样本中呈较强阳性。

但是这些研究者也未对RNF43具体分布在何种细胞进行详细描述，在其后续分析中也未考虑相关因素。

肿瘤微环境对肿瘤细胞的增殖、迁移等一系列行为均
有极为重要的影响，进一步明确RNF43的表达情况可能有更重要的意义。

4.2 RNF43的细胞内定位不同研究中RNF43在细胞内的定位情况不完全相同。

Sugiura等[1]通过在Hela细胞系等不表达RNF43的肿瘤细胞系内用质粒转入RNF43的方法研究了RNF43在胞内的定位情况。

在选择用典型核膜蛋白emerin 作为参照的免疫荧光实验中观察到RNF43与emerin共定位并验证其常驻于核膜，并运用类似方法发现RNF43在细胞内同时也存在着与内质网的结合。

对RNF43
在Wnt信号通路中功能的研究均显示其存在细胞膜定位[2,3,8,12]。

另有一项研究在表达RNF43的细胞的培养液中检测到RNF43，提示RNF43的信号肽可能存在介导其分泌的功能[16]，但也有其他研究者对培养液进行检测而并未检出RNF43
的报道[1]。

结合其蛋白结构看，RNF43是分泌型蛋白的可能性较小。

在某些病理情况下RNF43的胞内定位可能发生失调，并因此影响其在各信号通路中正常发挥功能，这通常由于RNF43基因发生突变导致。

4.3 RNF43表达和定位的研究现状从目前的研究结果看，对RNF43在Wnt
信号通路中效应的阐释是最为深入的部分，相关研究结果基本吻合。

但对比各项研究中作为次要论据而涉及的RNF43细胞内定位及组织表达情况时各方所报道的情况存在较多差异。

RNF43结构中含有N端信号肽，其PA结构域及其功能已有较多研究，而其Wnt 膜受体清除效应是通过与膜受体结合介导的，因此认为RNF43应该存在细胞膜定位是合理的。

Hao等[2]的研究ZNRF3/RNF43-GFP(green fluorescent protein)融合蛋白经免疫荧光检测表现出非常明确的细胞膜定位现象，与Koo等[17]的研
究结果一致。

然而，在其他诸多同样表达标签RNF43蛋白/RNF43荧光蛋白融合
蛋白的研究中，RNF43的细胞内定位情况差异性很大，如在Loregger等[7]的实
验中RNF43表现明确的细胞核定位而完全不呈现膜定位，Tsukiyama等[3]的研
究RNF43-EGFP(enhanced green fluorescent protein)表现胞质散在分布而同
样完全不呈现膜定位，其他许多不同研究在涉及RNF43的细胞内空间定位时也显示多种分布形式，并且通常在一项研究中RNF43不会具有多种细胞器定位。

在对组织切片中的RNF43进行免疫组化检测时，基本上无法观察到RNF43存在特定
细胞器定位，对比使用了识别不同RNF43肽段的抗体进行的不同研究时RNF43
也均显示弥散性表达。

不能简单认为RNF43的细胞内定位情况差异只是由于各实验室的差异化操作带来的偶然效应，其中应当具有更为深入的调控机制。

结构数据库预测RNF43在自然状态下可能由于选择性剪切而形成多种异构体，在除了长度为783 aa的标准形式外还有3种异构体形式：85～125位氨基酸缺失、长度742 aa；1～127位氨基酸缺失，长度656 aa；771～783位氨基酸序列改
变并由更多个氨基酸代替，长度869 aa。

这些异构体均保留了关键的锌指与跨膜
结构域。

异构体的形成可能与功能、表达调控有关，但目前调控这些异构体的形成及其功能的机制尚未有充分的探讨。

结合RNF43的不同定位情况看，有理由认为这些表现不同定位的RNF43可能在结构上并非完全相同。

各实验室研究RNF43的细胞定位时采用的技术手段可能影响了所获得的结果。

RNF43的CDS序列内存在2个可能的转录起始位点，分别对应全长(1～
783)RNF43及可能的一种异构体(128～783)RNF43。

Sugiura等[1]的免疫共沉
淀实验验证了在细胞系表达RNF43会产生多种不同分子量的RNF43，因此对于
在细胞内表达的RNF43在N-端还是C-端进行标签或GFP的融合需要更深入的思考。

添加标签后可能仅观察到一种结构的RNF43：在N-段标记显然会遗漏128～783异构体的存在，而鉴于C-端信号肽及869 aa形式的异构体的存在，在C端
标记可能也无法观察所有形式的RNF43。

因此需要不同的特异性抗体来鉴定不同
异构体的定位和功能差异。

RNF43在肿瘤组织样本中的表达量常与预后相关，通常表达量低预后差，表达量
高预后好。

在神经胶质瘤中，RNF43的表达量低与预后较差(更短生存期)相关[13]。

癌症和肿瘤基因图谱数据库(the cancer genome atlas, TCGA)对400多例结直肠癌患者的RNF43表达进行分析，结果显示高表达患者预后显著好于低表达者。

但也有RNF43表达量与预后无关的报道[14]以及在肝癌中RNF43高表达与侵袭性强、预后差相关的报道[18]，表明对RNF43抑癌还是促癌仍有争议。

RNF43在肿瘤中的突变非常普遍，其突变率很高，并且经常体现出等位基因不平
衡及野生型缺失现象。

2013年Ryland等对卵巢癌进行研究，结果显示在肿瘤患
者中RNF43的突变率位于第二梯队，与TP53及BRAF的突变率相当，仅次于KRAS的突变率，这一发现与Tan等[19]于2015年的检测结果相符合。

Sakamoto等[14]在57例胰腺导管内乳头状黏液性肿瘤样本中采用全外显子测序后对突变序列采用Sanger测序验证同时采用免疫组化法检测蛋白表达的策略，发现8例RNF43突变(14%)，包含5个移码(p.F69fs、p.S264fs、p.L311fs、
p.R363fs、p.V490fs)，1个错义(p.Q153X)，2个无义(p.I164N和p.P310A)突变。

其他研究报道的突变情况还有p.E174X、p.F69C、p.R330fs[20]、p.R225H、
p.M313V、p.E401K、p.R600G、p.I47V、p.P231L、p.L418M[16,21]、
p.P686R[22]、p.R117H、p.R221Q、p.R343H、p.K560fs、p.G659fs、
p.L619fs、p.L435fs、p.L7fs、p.R117fs、p.I186S、p.R127P、p.G130D和
p.M1I[21,23]等。

这些均提示RNF43的突变可能是肿瘤发生中的关键性因素之一。

RNF43在各不同类型肿瘤的突变情况相差较大，其代表性的高频突变也存在差异。

目前没有单个突变单独影响预后的报道，但如将存在突变作为统一的指标，能看到较一致的效应。

RNF43存在突变常会影响预后，而其突变在许多情况下与表达下
调相关[14]，二者常共同导致较差的预后。

一些对肝癌患者的研究显示RNF43突
变者生存期明显缩短。

同样的，RNF43突变的胃癌患者相对会有较差的预后。

胰
腺导管内乳头状黏液性肿瘤中RNF43突变患者的3年生存率较RNF43野生型患
者有下降趋势[19]。

突变影响预后的机制可能是这些突变使其酶活性结构域或整体
构型等产生改变而失去抑制功能。

p.C290S、p.H292S二种突变存在伴随关系，p.H295S、p.C298S这两者也存在伴随关系，这些突变均使E3酶活性结构域失活，使RNF43无法降解FZD而导致Wnt通路激活[1,17]。

RNF43的突变情况和一些其他因素存在关联，例如微卫星状态以及一些其他关键
性原癌基因的突变情况。

在结直肠癌中，高频微卫星不稳定性与RNF43高突变相关，而RNF43突变和APC突变则很少同时发生[23]。

RNF43研究大致阐明了其在Wnt信号通路中的功能地位，其与通路上各蛋白相互作用的结构信息基本确认。

从Wnt信号通路调控的角度看，RNF43应当是一抑癌基因，多组临床研究报道高表达预后好，支持这一结论。

但也有一些研究认为RNF43具有促癌功能，是一癌基因。

这些争议有待进一步深入探讨。

RNF43的临床突变类型非常丰富，其结构域的细微改变对其功能可能有重大影响，但各突变的确切功能尚不清楚。

RNF43突变后效应较强，可能作为新的药物靶标。

对RNF43表达、突变情况的检测也可能在临床上具有潜在的诊断价值。

【相关文献】
[1] Sugiura T, Yamaguchi A, Miyamoto K. A cancer-associated RING finger protein,
RNF43, is a ubiquitin ligase that interacts with a nuclear protein, HAP95[J]. Exp Cell Res, 2008,314(7):1519-28.
[2] Hao H X, Xie Y, Zhang Y, et al. ZNRF3 promotes Wnt receptor turnover in an R-spondin-sensitive manner[J]. Nature, 2012,485(7397):195-200.
[3] Tsukiyama T, Fukui A, Terai S, et al. Molecular role of RNF43 in canonical and noncanonical Wnt signaling[J]. Mol Cell Biol, 2015,35(11):2007-23.
[4] Koo B K, van Es J H, van den Born M, et al. Porcupine inhibitor suppresses paracrine Wnt-driven growth of Rnf43; Znrf3-mutant neoplasia[J]. Proc Natl Acad Sci USA,
2015,112(24):7548-50.
[5] Nailwal H, Sharma S, Mayank A K, et al. The nucleoprotein of influenza A virus induces p53 signaling and apoptosis via attenuation of host ubiquitin ligase RNF43[J]. Cell Death Dis, 2015,6(5):e1768.
[6] Shinada K, Tsukiyama T, Sho T, et al. RNF43 interacts with NEDL1 and regulates p53-mediated transcription[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,404(1):143-7.
[7] Loregger A, Grandl M, Mejías-Luque, et al. The E3 ligase RNF43 inhibits Wnt signaling downstream of mutated β-catenin by sequestering TCF4 to the nuclear membrane[J].Sci Signal, 2015,8(393):ra90.
[8] Jiang X, Charlat O, Zamponi R, et al. Dishevelled promotes Wnt receptor degradation through recruitment of ZNRF3/RNF43 E3 ubiquitin ligases[J]. Mol Cell, 2015,58(3):522-33.
[9] Li Y, Ozaki T, Kikuchi H, et al. A novel HECT-type E3 ubiquitin protein ligase NEDL1 enhances the p53-mediated apoptotic cell death in its catalytic activity-independent manner[J]. Oncogene, 2008,27(26):3700-9.
[10] Peng W C, de Lau W, Madoori P K, et al. Structures of Wnt-antagonist ZNRF3 and its complex with R-spondin 1 and implications for signaling[J]. PLoS One, 2013,8(12):e83110.
[11] Chen P H, Chen X, Lin Z, et al. The structural basis of R-spondin recognition by LGR5 and RNF43[J]. Genes Dev, 2013,27(12):1345-50.
[12] Takahashi N, Yamaguchi K, Ikenoue T, et al. Identification of two Wnt-responsive elements in the intron of RING finger protein 43 (RNF43) gene[J]. PLoS One,
2014,9(1):e86582.
[13] Xi S, Zhang X, Chen H, et al. Downregulation of ring-finger protein 43 in glioma associates with poor prognosis[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2015,8(1):490.
[14] Sakamoto H, Kuboki Y, Hatori T, et al. Clinicopathological significance of somatic RNF43 mutation and aberrant expression of ring finger protein 43 in intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas[J]. Mod Pathol, 2015, 28(2):261-7.
[15] Jo Y S, Kim M S, Lee J H, et al. Frequent frameshift mutations in 2 mononucleotide repeats of RNF43 gene and its regional heterogeneity in gastric and colorectal cancers[J]. Hum Pathol, 2015,46(11):1640-6.
[16] Yagyu R, Furukawa Y, Lin Y M, et al. A novel oncoprotein RNF43 functions in an autocrine manner in colorectal cancer[J]. Int J Oncol, 2004,25(5):1343-8.
[17] Koo B K, Spit M, Jordens I, et al. Tumour suppressor RNF43 is a stem-cell E3 ligase that induces endocytosis of Wnt receptors[J]. Nature, 2012,488(7413):665-9.
[18] Xing C, Zhou W, Ding S, et al. Reversing effect of ring finger protein 43 inhibition on malignant phenotypes of human hepatocellular carcinoma[J]. Mol Cancer Ther,
2013,12(1):94-103.
[19] Tan M C, Basturk O, Brannon A R, et al. GNAS and KRAS mutations define separate progression pathways in intraductal papillary mucinous neoplasm-associated carcinoma[J]. J Am Coll Surg, 2015,220(5):845-54.
[20] Jiang X, Hao H X, Growney J D, et al. Inactivating mutations of RNF43 confer Wnt dependency in pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Pro Natl Acad Sci USA,
2013,110(31):12649-54.
[21] Ota T, Suzuki Y, Nishikawa T, et al. Complete sequencing and characterization of 21,243 full-length human cDNAs[J]. Nat Genet, 2004,36(1):40-45.
[22] Bechtel S, Rosenfelder H, Duda A, et al. The full-ORF clone resource of the german cDNA consortium[J]. BMC Genomics, 2007,8:399.
[23] Giannakis M, Hodis E, Mu X J, et al. RNF43 is frequently mutated in colorectal and endometrial cancers[J]. Nat Genet, 2014,46(12):1264-6.。