高效液相(HPLC)检测5种氨基酸在酮酸制备过程中的应用
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
TECHNOLOGY APPLICATION |後术应用
摘要:过去氨基酸分析必须应用价格昂贵的专一的氦基酸分析仪,近几年来越来越多的人应用高效液相进行氨基酸定量分析。
建立一种测定酮酸制备过程中,5种氛基酸原料卜亮氛酸、L-异亮氦酸、b笨丙氨酸、L-缬氛酸、L-蛋氛酸的液相分析方法。
以乙腈-磷酸氫二胺水溶液为流动相,采用H P L C对氨基酸进行含量测定。
当乙腈-50M m磷酸氢二胺水溶液(pH=2.6) =73:27, 最适检测波长205n m。
经验证,本方法的线性关系良好,其中L-亮氛酸R2=1、L-缬氨酸R2=1、L-异亮氣酸R2=1、L-苯丙氛酸R2=0.9997、L-蛋氣酸R2=0.9996»本方法具有操作便捷、结果准确的特点,且重复性好,适用于氛基酸的快速定量测定。
关键词:L-亮氨酸;L-异亮氨酸;L-笨丙氛酸:L-级氨酸;L-蛋氨酸:高效液相(L-leucine)
高效液相(H P LC)检测5种氨基酸在酮酸制备过程中的应用
■文/王阳张玉锋王昭
复方a-酮酸的主要组成成分为酮亮氨酸钙、酮异亮氨 酸钙、酮苯丙氨酸钙、酮缬氨酸钙、羟蛋氨酸钙,在体内利 用非必需氨基酸的氮转化为亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、蛋氨酸而发挥作用。
此5种氨基酸为人体8种必需 氨基酸之一,属于支链氨基酸,是组成蛋白质的20种氨基 酸之一,氨基酸对人体的作用是巨大的,能够为机体提供能 量,所以补充氨基酸是很有必要的。
L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸是制备5种酮酸钙的起 始原料,由于生产前需对原料药进行质量检测。
现有技术中 公开了在线衍生-液相色谱的检测方法,但该方法检测时间 长,且需梯度洗脱,氨基酸检测预处理步骤复杂,且只能检 测一种氨基酸,对高效液相色谱仪、配制流动相的试剂要求 较高。
因此,建立快速准确的氨基酸定量检测方法,以满足 生产过程中质量控制的需要。
1.实验
1.1试剂与仪器
L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸5种氨基酸(味之素),乙腈(色谱纯),磷酸氢 二胺(分析纯),磷酸(分析纯)、岛津LC-10AT液相色 谱仪。
1.2溶液配制
精密称取一定量的L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸,用流动相溶解定容到50m l容量瓶 中,再分别稀释得到不同浓度的标准样品溶液。
1.3色谱条件
色谱柱:(安捷伦)氨基键合硅胶柱,250mmX4.6mm,填充 5um。
流动相:乙腈-50M m磷酸氢二胺水溶液(pH=2.6) =73:27,流速 0.7ml/min,波长 205nm,柱温 30°C,进样量为 20 U1。
1.4方法
1.4. 1对照、样品供试液配制
称取L-亮氨酸、L-异亮氨酸、L-缬氨酸标品20.0mg 于50m l容量瓶中,用流动相溶解并稀释至刻度;称取L-苯 丙氨酸、L-蛋氨酸标品20m l于50m丨容量瓶中,用流动相 定容,摇匀,取lm l至10m l容量瓶,用流动相溶解并稀释 至刻度。
样品供试液配制:根据各个氨基酸残留,稀释。
1.4.2线性回归
配置溶液适量,按比例稀释,L-亮氨酸、L-异亮 氨酸、L-缬氨酸分别相当于每m l含320 u g、360 u g、400 u g、440 u g、480 P g的标品溶液:L-苯丙氨酸、L-蛋氨酸分别相当于每m l含32 u g、36 u g、40 u g、44 u g、48 u g的标品溶液。
依法测定,以面 积为纵坐标,以质量浓度为横坐标,得到线性回归方程:L-亮氨酸为y=606.02x-48.116R2=l,L-异亮氨酸为 y=601.48x+53.214R2=l,L-缬氨酸为y=675.52x-457.3R2=1, L-蛋氨酸为 y=10726x-2876.9R2=0.9996, L-苯丙氨酸为y=44909x-27771R2=0.9997。
表明上述5种氨 基酸在质量浓度为320~480 u g/m l范围内与峰面积具有较好的线性关系,符合限度实验要求。
1.4. 3回收率试验
将供试品与对照溶液按比例混匀,配置为80%、90%、100%、110%、120% 的溶液。
1.4. 4重复性
取标品溶液20 u l注入高效液相色谱,重复6针,L-异 亮氨酸峰面积分别为247835、247212、247560、247989、247459、247873,平均值为247654, RSD为 0.12%; L-亮 氨酸峰面积分别为 246028、245569、245786、246563、
2021年第5期⑨中国高新科技125
枝术应用丨 TECHNOLOGY APPLICATION
表1L-异亮氩酸回收率实验
序号浓度(Wg/ml)计算浓度(u g/ml)回收率(%) 1320. 48321.54100.11 2361.05361. 1599.94 3401.50400. 8999.68 4442. 02442. 56100.21 5481.30482. 53100. 24注:L-异亮氛酸回收率为99.68%〜100.24%
表5 L-蛋氩酸回收率实验
序号浓度(lig/ml)计算浓度(u g/ml)回收率(%) 132.57632.4599.61 236.64836.3299.10 340.72040.83100.27 444.79244.90100.24 548.86448.5699.38注:L-蛋氨酸回收率为99.38°/100.27%
表2 L-亮氛酸回收率实验
序号浓度(P g/ml)计算浓度(^ g/ml)回收率(%) 1322.88321.499.54 2363.24363.51100.07 3403.6404.86100.31 4443.96444.89100.21 5484.32486.2100.39注:L-亮氛酸回收率为99.54%〜100.39%
表3 L-缬氨酸回收率实验
序号浓度(U g/m l)计算浓度(u g/ml)回收率(%) 1325.44325.8100.11 2366.12365.1399.73 3406.80407.86100.26 4447.48446.5999.80 5488.16488.95100.16注:L-缬氛酸回收率为99.73%~丨00.26%
表4 L-苯丙氨酸回收率实验
序号浓度(u g/ml)计算浓度(u g/ml)回收率(%) 132.57632.4099.46 236.64836.89100.66 340.72040.89100.42 444.79245.20100.91 548.86448.8599.97注:L-苯丙氦酸回收率为99.46%〜100.91%245625、246325,平均值为245982, RSD为 0.16%; L-绳 氨酸峰面积分别为 274107、273203、274890、274105、273204、274402 平均值为 273985, RSD 为 0.24%: L-苯 丙氨酸峰面积为 1824233、1818024、1828445、1827336、1826459、1827657,平均值为 1825359, RSD 为 0.21%; L-蛋氨酸为443736、441987、442183、443598、443254、442758,平均值为442919, R SD为0.17°/。
,表明重复性良好。
1.4.5分离度、拖尾因子
取供试品溶液
20u l注入高效液相
色谱,5种氨基酸与
相邻杂质峰的分离度
分别是L-异亮氨酸
分离度为1.53,拖尾
图1色谱图(亮、缬、异亮、苯丙、因子为1.25; L-亮 H i r g)
氨酸分离度为3.12,
拖尾因子为1.1, L-缬氨酸分离度为1.72,拖尾因子为0.85, L-苯丙氨酸分离度为3.71,拖尾因子为0.98, L-蛋氨酸分离度为1.88,拖尾因子为0.95,表明分离度和峰行符合要求。
L-异亮、亮、缬、苯丙、蛋氨酸的液相图谱,11.7min为L-苯丙氨酸,14.02min为L-亮氨酸,15.72min为L-异亮氨酸,16.84min为L-蛋氣酸,21.75m in为L-織氨酸。
2.结语
本文建立了 HPLC法分离测定酮酸原料中主要的原料残 留的方法,该方法可以定量检测酮酸转化液中存在的L-异 亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苯丙氨酸、L-缬氨酸等 原料残留,为酮酸转化提供了检测分析方法。
(作者单位:精晶药业股份有限公司)
126中国高新科技2021年第5
期。