DNA甲基化检测 ppt课件
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(３） Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物 进行 qPCR检测得到 Ct值(Input）。ChIP DNA样品作为模板， 用待测基因特异性引物进行 qPCR检测得到 Ct值(ChIP ）。样 品 ＤＮＡ 甲基化相对量（ChIP/Total input）通过以下公式计 算: ChIP/Total input=2^ [Ct(Input)-Ct(ChIP)] 通过结果可见脊髓损伤后,大鼠腓肠肌 eif5a基因 DNA甲基 化水平降低。此结果与我们之前得到的 eif5a在脊髓损伤大鼠 腓肠肌中高表达结果相吻合(图8-3）。
甲基化 DNA免疫沉淀法是一种高效富集甲基化 DNA的方法 ꎮ。在该方法中，可与 5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组 DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀， 形成富集，通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行 大规模DNA甲基化分析。 该方法简便、特异性高，适合 DNA甲基化组学的分析。 高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化状态的有力工具。
单链DNA在亚硫酸氢钠存在的条件下,能有效地将未甲 基化的脱氧 胞嘧啶(C)转化为脱氧尿嘧啶(U),随后作PCR 扩 增。此过程进一步将模板上的尿嘧啶(U),进一步转化为脱氧 胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亚硫酸氢钠影响保 持不变。使DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的 差异，根据这种差异即可以获得目的片段的甲基化信 息.MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA,然后设计针 对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳确定与引物互补的 ＤＮＡ 序列的甲基化 PPT课件 状态。
表观遗传学是一种可遗传的调节基因表达的机制。不同于 经典遗传学，表观遗传学不涉及基因序列的改变，而且表观遗 传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。 DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常 细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾 病的发生、发展中起着重要作用。 DNA甲基化是指，在DNA甲基转移酶（DNMT)作用下以S腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，将甲基转移到DNA脱氧胞 嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过 程 这一过程通常发生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常见 的哺乳动物基因组DNA后天修饰。 PPT课件
DNA去甲基化机制：TET蛋白家族是重要的去甲基化酶， 具有催化5-mC羟基化的酶活性，使5-mC修饰成为5-羟甲基 胞嘧啶（5-hmC）， 5-hmC可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶 （TDG)识别并切除，在通过碱基切除修复途径最终将该位点 转化为C，从而实现DNA去甲基化。
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DNA甲基化虽未改变核苷酸顺序及其组成，但普遍认为可 在转录水平调控基因的表达，尤其是转录起始阶段。一般来说， 基因启动子区CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与DNA 结合而抑制基因的转录，而该区域的去甲基化则可以激活基因 的转录。另外，DNA甲基化还可能直接抑制RNA聚合酶活性而 抑制基因的表达。此外，细胞内还存在一些专门与甲基化序列 结合的蛋白质，如果甲基化的转录元件被这样的蛋白质结合就 抑制了转录因子的正常结合。
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5Байду номын сангаас
二、DNA甲基化与疾病
DNA甲基化在脊椎动物胚胎早期发育中有重要作用， Dnmt基因的缺失会影响胚胎早期发育和多个器官的形成及 分化。如胚胎早期致死、内脏器官和神经系统终末分化缺 陷以及血液发生紊乱等。
单基因水平及基因组范围内的 ＤＮＡ 甲基化改变在肿瘤发 生发展中亦发挥重要作用。
DNA甲基化的异常改变可能是动脉粥样硬化发生的早期标 志。 长期酒精摄取可以导致神经环路 ＤＮＡ 甲基化的改变。 ＤＮＡ 甲基化异常可能与自身免疫性疾病相关。
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三、DNA甲基化检测方法
总 DNA甲基化定量试剂盒试验中，DNA被固定在联管中， 这些联管已经被处理过，具备高 DNA亲和力ꎮ。DNA甲基 化的部分能够通过 5-甲基胞嘧啶抗体辨识并通过 ELISA(酶 联免疫吸附试验)之类反应进行定量。DNA甲基化的量同 OD 强度成一定比例。手动或者高通量分析整个操作仅需要 4小 时。
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高分辨率熔解是一种不需要PCR 产物后续操作的简单 且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。采用重亚硫酸盐处 理DNA模板后在PCR反应前，在非CpG岛位置设计一对针 对经亚硫酸氢钠处理后DNA 链的引物，这对引物中间包含 有意义的甲基CpG岛，一旦这些 CpG岛发生甲基化，胞嘧 啶不发生变化而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶。样品 中的 GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解Tm值之间 的差异CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰 的形状产生影响，因此，根据 Tm值和熔解峰的形状可以检 测出样本的甲基化位点和甲基化程度。
高效液相色谱是根据DNA或蛋白质相对分子质量和构象 的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的 光吸收度并不相同而加以定量， 随着系统的压强的增加， 其分辨率增高，故而能够定量测定基因组整体水平 DNA甲 基化水平。过程是将 DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱 基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光 测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积就得 到基因组整体的甲基化水平。 高效毛细管电泳法是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从 复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下 PPT课件 不同分子的由于其所带电荷、大小、结构以及疏水性等不
（二）使用MethPrimer进行甲基化 CpG 岛的预测
（1）打开网址将上述复制的序列信息粘贴在对话框中，‘pick primer for…’和‘pick MSP primers…’选项默认。点击 ‘submit’即可。
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（2）得到预测的 CpG岛为图中蓝色区域。 在预测图下方会有具体的 文字信息， 从该信息表我们可以看到软件预测得到两个 CpG岛。从 预测图可见第二个岛过大， 我们将对第一个岛甲基化水平进行检测。 根据表格中的信息得到我们复制得到的序列从 2541-2747bp为 CpG岛。
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第二节 DNA甲基化的预测
一、 实 验 目 的
预测大鼠基因 eif5a(geneID;287444)启动子区域甲基化 CpG岛分布。
二、 实 验 原 理
使用 ensembl查找 eif5a基因的序列信息，再使用MethPrimer进行 甲基化 CpG 岛的预测
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三、实验方法
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五、实验注意事项
该实验需要注意，DNA一定要断裂为 250bp左右的小片段。 如果片段过大，会导致抗体富集甲基化 DNA时，将甲基化和非 甲基化区域全部富集出来，最后的 PCR定量时会导致甲基化水 平无法分辨出来，产生假阴性结果。如果片段过小，小于 PCR 引物产物的大小，会导致PCR无法扩增模板。 在使用试剂盒进行富集甲基化DNA时，没有被磁珠富集 DNA片段要用 wash buffer洗干净，以免干扰实验结果。 在磁 力架上吸取液体是要小心，一是尽量洗干净，二是不要吸走磁 珠。 此外，本实验引物设计也很重要，选择的CPG岛不要太大， 否则高 CG含量的片段进行PCR扩增，会增加难度。如果CG含 量过高，引物的PCR产物不要太长，100-300bp较适宜。
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三、实验材料与方法
（一）实验材料 1、所需设备
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2、所需试剂
（二）实验具体方法和操作步骤
1、DNA提取 2、超声破碎DNA和电泳检测 3、甲基化DNA的富集
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四、实验结果 （1）对超声后的 DNA进行电泳，与阳性对照（Hela）类似，样 品DNA被成功打断成250bp左右的片段(图8-1） (２) 同时对甲基化DNA富集前的 input DNA和甲基化富集DNA进 行 PCR,扩增片段如图8-2。扩增曲线在 20-30循环起跳，表示样 本含量处于合理范围内。溶解曲线单峰，表示扩增特异性较好。
（一）使用 ensembl查找 eif5a基因的序列信息 （1）打开ensembl
（2）输入种属：‘rat’基因名称‘eif5a’点击“GO”开始 搜索
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（3）在搜索结果中点击第一个“eif5a（rat gene）”，进入该基因 信息界面。
（4）点击左侧的‘sequence’得到DNA序列信息
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甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方 法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的 DNA序 列。由于在真核 DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的 胞嘧啶能够被甲基化，因此在酶切位点内包含CG序列的限 制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶 对是HPa Ⅱ -Msp Ⅰ (CCGG）。两个酶都识别CCGG序列， 而当其中的胞嘧啶甲基化时， HPa Ⅱ不能够将其切开，利 用HPa Ⅱ -Msp Ⅰ的这种属性处理DNA，这就使得 HPa Ⅱ -Msp Ⅰ能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行 Southern或 PCR扩增分离产物明确甲基化状态。
第八章
DNA甲基化检测
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第一节 DNA甲基化概述 一、DNA甲基化的分子机制 二、DNA甲基化与疾病 三、DNA甲基化检测方法 第二节 DNA甲基化的预测 第三节 MeDIP-PCR检测eif5a基因在脊髓损伤大鼠腓肠肌 的DNA甲基化改变
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第一节
DNA甲基化概述
一、DNA甲基化的分子机制
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第三节 MeDIP-PCR检测eif5a基因在脊髓损伤大鼠 腓肠肌的DNA甲基化改变
一、 实 验 目 的 之前我们使用MethPrimer软件成功预测到大鼠 eif5a基因 在启动子区域存在甲基化CpG岛。 现在，我们使用ChIPqPCR 技术对大鼠脊髓损伤后腓肠肌eif5a基因甲基化状态进行 鉴定。 二、 实 验 原 理 ChIP技术利用甲基化 DNA特异性抗体富集被甲基化修饰 的 DNA片段； qPCR技术使用 SYBR荧光染料，非特异性的掺 入DNA双链，发射荧光，保证荧光信号的增加与 ＰＣＲ 产物 的增加完全同步，最后利用 Ct值对富集得到的甲基化 DNA片 段进行相对定量分析。ChIP-qPCR 能够专一、灵敏、快速、 PPT课件 高重复地定量生物样品中甲基化修饰的 DNA。
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CpG岛（CGI）： CpG在基因中呈不均匀分布，富含CpG二 核苷酸序列的片段成为CpG岛
哺乳动物的DNMTs主要包括DNMT1、 DNMT3A、 DNMT3B、和DNMT3L。 DNMT1作用于仅有一条甲基化的 DNA双链。使其完全甲基化，保证甲基化方式在秦代和子代之 间的传递。 DNMT3A和DNMT3BB属于从头甲基化酶，可使非 甲基化CpG位点发生甲基化，继而使半甲基化的位点发生全甲 基化。 DNMT3L本身并不具有DNA甲基化转移酶活性，可能 通过调节DNMT3A或DNMT3B的功能发挥作用。
（5）点击左侧的‘configure this page’进行设置。在弹出的对话框 中将‘5 ´flanking sequence(upstream)’改为3000。即可得到eif5a基 因上游3000bp序列信息。设置完成点击对话框右上角的‘对勾’即可。
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（6）从开始选择一个序列一直到第一个外显子后。复制这一 段序列。
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(３） Total input DNA样品作为模板，用待测基因特异性引物 进行 qPCR检测得到 Ct值(Input）。ChIP DNA样品作为模板， 用待测基因特异性引物进行 qPCR检测得到 Ct值(ChIP ）。样 品 ＤＮＡ 甲基化相对量（ChIP/Total input）通过以下公式计 算: ChIP/Total input=2^ [Ct(Input)-Ct(ChIP)] 通过结果可见脊髓损伤后,大鼠腓肠肌 eif5a基因 DNA甲基 化水平降低。此结果与我们之前得到的 eif5a在脊髓损伤大鼠 腓肠肌中高表达结果相吻合(图8-3）。
甲基化 DNA免疫沉淀法是一种高效富集甲基化 DNA的方法 ꎮ。在该方法中，可与 5mC特异性结合的抗体加入到变性的 基因组 DNA片段中，从而使甲基化的基因组片段免疫沉淀， 形成富集，通过与已有DNA微芯片技术相结合，从而进行 大规模DNA甲基化分析。 该方法简便、特异性高，适合 DNA甲基化组学的分析。 高密度的甲基化芯片是研究全基因甲基化状态的有力工具。
单链DNA在亚硫酸氢钠存在的条件下,能有效地将未甲 基化的脱氧 胞嘧啶(C)转化为脱氧尿嘧啶(U),随后作PCR 扩 增。此过程进一步将模板上的尿嘧啶(U),进一步转化为脱氧 胸腺嘧啶(T),而甲基化的胞嘧啶(mC)不受亚硫酸氢钠影响保 持不变。使DNA片段甲基化状态的差异转化为碱基序列的 差异，根据这种差异即可以获得目的片段的甲基化信 息.MSP法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA,然后设计针 对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR 扩增，最后通 过琼脂糖凝胶电泳确定与引物互补的 ＤＮＡ 序列的甲基化 PPT课件 状态。
表观遗传学是一种可遗传的调节基因表达的机制。不同于 经典遗传学，表观遗传学不涉及基因序列的改变，而且表观遗 传修饰是可逆的，在基因调控中起重要作用。 DNA甲基化是表观遗传学主要调控机制之一，在维持正常 细胞功能、遗传印记、胚胎发育、染色质结构改变以及人类疾 病的发生、发展中起着重要作用。 DNA甲基化是指，在DNA甲基转移酶（DNMT)作用下以S腺苷甲硫氨酸（SAM)作为甲基供体，将甲基转移到DNA脱氧胞 嘧啶的第五位C，形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过 程 这一过程通常发生在二核苷酸CpG中的胞嘧啶，是最常见 的哺乳动物基因组DNA后天修饰。 PPT课件
DNA去甲基化机制：TET蛋白家族是重要的去甲基化酶， 具有催化5-mC羟基化的酶活性，使5-mC修饰成为5-羟甲基 胞嘧啶（5-hmC）， 5-hmC可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶 （TDG)识别并切除，在通过碱基切除修复途径最终将该位点 转化为C，从而实现DNA去甲基化。
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DNA甲基化虽未改变核苷酸顺序及其组成，但普遍认为可 在转录水平调控基因的表达，尤其是转录起始阶段。一般来说， 基因启动子区CpG岛的甲基化可以使一些转录因子无法与DNA 结合而抑制基因的转录，而该区域的去甲基化则可以激活基因 的转录。另外，DNA甲基化还可能直接抑制RNA聚合酶活性而 抑制基因的表达。此外，细胞内还存在一些专门与甲基化序列 结合的蛋白质，如果甲基化的转录元件被这样的蛋白质结合就 抑制了转录因子的正常结合。
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5Байду номын сангаас
二、DNA甲基化与疾病
DNA甲基化在脊椎动物胚胎早期发育中有重要作用， Dnmt基因的缺失会影响胚胎早期发育和多个器官的形成及 分化。如胚胎早期致死、内脏器官和神经系统终末分化缺 陷以及血液发生紊乱等。
单基因水平及基因组范围内的 ＤＮＡ 甲基化改变在肿瘤发 生发展中亦发挥重要作用。
DNA甲基化的异常改变可能是动脉粥样硬化发生的早期标 志。 长期酒精摄取可以导致神经环路 ＤＮＡ 甲基化的改变。 ＤＮＡ 甲基化异常可能与自身免疫性疾病相关。
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三、DNA甲基化检测方法
总 DNA甲基化定量试剂盒试验中，DNA被固定在联管中， 这些联管已经被处理过，具备高 DNA亲和力ꎮ。DNA甲基 化的部分能够通过 5-甲基胞嘧啶抗体辨识并通过 ELISA(酶 联免疫吸附试验)之类反应进行定量。DNA甲基化的量同 OD 强度成一定比例。手动或者高通量分析整个操作仅需要 4小 时。
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高分辨率熔解是一种不需要PCR 产物后续操作的简单 且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。采用重亚硫酸盐处 理DNA模板后在PCR反应前，在非CpG岛位置设计一对针 对经亚硫酸氢钠处理后DNA 链的引物，这对引物中间包含 有意义的甲基CpG岛，一旦这些 CpG岛发生甲基化，胞嘧 啶不发生变化而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶。样品 中的 GC含量发生了变化，最终被转化成了熔解Tm值之间 的差异CpG位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰 的形状产生影响，因此，根据 Tm值和熔解峰的形状可以检 测出样本的甲基化位点和甲基化程度。
高效液相色谱是根据DNA或蛋白质相对分子质量和构象 的不同而使其加以分离。由于在动态相和静态相下分子的 光吸收度并不相同而加以定量， 随着系统的压强的增加， 其分辨率增高，故而能够定量测定基因组整体水平 DNA甲 基化水平。过程是将 DNA样品先经盐酸或氢氟酸水解成碱 基，水解产物通过色谱柱，结果与标准品比较，用紫外光 测定吸收峰值及其量，计算5mC/(5mC+5C)的积分面积就得 到基因组整体的甲基化水平。 高效毛细管电泳法是一种利用窄孔熔融石英毛细管来从 复合物中分离不同化学组分的技术。其基础是在强电场下 PPT课件 不同分子的由于其所带电荷、大小、结构以及疏水性等不
（二）使用MethPrimer进行甲基化 CpG 岛的预测
（1）打开网址将上述复制的序列信息粘贴在对话框中，‘pick primer for…’和‘pick MSP primers…’选项默认。点击 ‘submit’即可。
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（2）得到预测的 CpG岛为图中蓝色区域。 在预测图下方会有具体的 文字信息， 从该信息表我们可以看到软件预测得到两个 CpG岛。从 预测图可见第二个岛过大， 我们将对第一个岛甲基化水平进行检测。 根据表格中的信息得到我们复制得到的序列从 2541-2747bp为 CpG岛。
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第二节 DNA甲基化的预测
一、 实 验 目 的
预测大鼠基因 eif5a(geneID;287444)启动子区域甲基化 CpG岛分布。
二、 实 验 原 理
使用 ensembl查找 eif5a基因的序列信息，再使用MethPrimer进行 甲基化 CpG 岛的预测
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三、实验方法
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五、实验注意事项
该实验需要注意，DNA一定要断裂为 250bp左右的小片段。 如果片段过大，会导致抗体富集甲基化 DNA时，将甲基化和非 甲基化区域全部富集出来，最后的 PCR定量时会导致甲基化水 平无法分辨出来，产生假阴性结果。如果片段过小，小于 PCR 引物产物的大小，会导致PCR无法扩增模板。 在使用试剂盒进行富集甲基化DNA时，没有被磁珠富集 DNA片段要用 wash buffer洗干净，以免干扰实验结果。 在磁 力架上吸取液体是要小心，一是尽量洗干净，二是不要吸走磁 珠。 此外，本实验引物设计也很重要，选择的CPG岛不要太大， 否则高 CG含量的片段进行PCR扩增，会增加难度。如果CG含 量过高，引物的PCR产物不要太长，100-300bp较适宜。
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三、实验材料与方法
（一）实验材料 1、所需设备
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2、所需试剂
（二）实验具体方法和操作步骤
1、DNA提取 2、超声破碎DNA和电泳检测 3、甲基化DNA的富集
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四、实验结果 （1）对超声后的 DNA进行电泳，与阳性对照（Hela）类似，样 品DNA被成功打断成250bp左右的片段(图8-1） (２) 同时对甲基化DNA富集前的 input DNA和甲基化富集DNA进 行 PCR,扩增片段如图8-2。扩增曲线在 20-30循环起跳，表示样 本含量处于合理范围内。溶解曲线单峰，表示扩增特异性较好。
（一）使用 ensembl查找 eif5a基因的序列信息 （1）打开ensembl
（2）输入种属：‘rat’基因名称‘eif5a’点击“GO”开始 搜索
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（3）在搜索结果中点击第一个“eif5a（rat gene）”，进入该基因 信息界面。
（4）点击左侧的‘sequence’得到DNA序列信息
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甲基化敏感的限制性内切酶方法是经典的甲基化分析方 法，主要根据一些限制性内切酶不能切开甲基化的 DNA序 列。由于在真核 DNA或者哺乳动物DNA中，只有CG相连的 胞嘧啶能够被甲基化，因此在酶切位点内包含CG序列的限 制性内切酶就会遇到问题。这种方法所使用的两个经典酶 对是HPa Ⅱ -Msp Ⅰ (CCGG）。两个酶都识别CCGG序列， 而当其中的胞嘧啶甲基化时， HPa Ⅱ不能够将其切开，利 用HPa Ⅱ -Msp Ⅰ的这种属性处理DNA，这就使得 HPa Ⅱ -Msp Ⅰ能够作为快速甲基化分析的工具，随后进行 Southern或 PCR扩增分离产物明确甲基化状态。
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第一节 DNA甲基化概述 一、DNA甲基化的分子机制 二、DNA甲基化与疾病 三、DNA甲基化检测方法 第二节 DNA甲基化的预测 第三节 MeDIP-PCR检测eif5a基因在脊髓损伤大鼠腓肠肌 的DNA甲基化改变
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一、 实 验 目 的 之前我们使用MethPrimer软件成功预测到大鼠 eif5a基因 在启动子区域存在甲基化CpG岛。 现在，我们使用ChIPqPCR 技术对大鼠脊髓损伤后腓肠肌eif5a基因甲基化状态进行 鉴定。 二、 实 验 原 理 ChIP技术利用甲基化 DNA特异性抗体富集被甲基化修饰 的 DNA片段； qPCR技术使用 SYBR荧光染料，非特异性的掺 入DNA双链，发射荧光，保证荧光信号的增加与 ＰＣＲ 产物 的增加完全同步，最后利用 Ct值对富集得到的甲基化 DNA片 段进行相对定量分析。ChIP-qPCR 能够专一、灵敏、快速、 PPT课件 高重复地定量生物样品中甲基化修饰的 DNA。
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CpG岛（CGI）： CpG在基因中呈不均匀分布，富含CpG二 核苷酸序列的片段成为CpG岛
哺乳动物的DNMTs主要包括DNMT1、 DNMT3A、 DNMT3B、和DNMT3L。 DNMT1作用于仅有一条甲基化的 DNA双链。使其完全甲基化，保证甲基化方式在秦代和子代之 间的传递。 DNMT3A和DNMT3BB属于从头甲基化酶，可使非 甲基化CpG位点发生甲基化，继而使半甲基化的位点发生全甲 基化。 DNMT3L本身并不具有DNA甲基化转移酶活性，可能 通过调节DNMT3A或DNMT3B的功能发挥作用。
（5）点击左侧的‘configure this page’进行设置。在弹出的对话框 中将‘5 ´flanking sequence(upstream)’改为3000。即可得到eif5a基 因上游3000bp序列信息。设置完成点击对话框右上角的‘对勾’即可。
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