安罗替尼对人胃癌细胞迁移、侵袭的影响及机制

安罗替尼对人胃癌细胞迁移、侵袭的
影响及机制
邓双年1，李娟2，李辉3
1 临汾市人民医院肿瘤科，山西临汾 041000；
2 临汾市人民医院消化科；
3 临汾市人民医院胸外科
摘要：目的　探究安罗替尼对人胃癌细胞迁移、侵袭的影响及机制。

方法　体外培养人胃癌AGS 细胞，取第3代对数生长期AGS 细胞，分为对照组（不做干预）、实验组（2 µmol /L 安罗替尼组、4 µmol /L 安罗替尼组、8 µmol /L 安罗替尼组）和抑制剂组［4 µmol /L 安罗替尼＋10 µmol /L 转化生长因子-β1（TGF -β1）/Smads 信号通路抑制剂LY2109761］，干预24 h 。

为避免细胞死亡太多干扰实验，抑制剂组选取4 µmol /L 安罗替尼作为最适浓度加入10 µmol /L TGF -β1/Smads 通路抑制剂LY2109761进行后续实验。

用CCK -8法、倒置显微镜、Transwell 小室及Western blotting 法对细胞活力、细胞形态、迁移、侵袭能力及上皮间质转化（EMT ）、TGF -β1/Smads 信号通路相关蛋白表达进行检测。

结果　与对照组相比，4、8 µmol /L 安罗替尼组细胞活力降低（P 均<0.05）。

实验组人胃癌AGS 细胞生长受
到抑制，迁移、侵袭能力及TGF -β1、p -Smad3、N -钙黏蛋白（N -cadherin ）、波形蛋白（Vimentin ）、纤维黏连蛋白（FN ）蛋白表达降低（P 均<0.05），Smad7和E -钙黏蛋白（E -cadherin ）蛋白表达升高，且呈浓度依赖性（P 均<0.05）；与4 µmol /L 安罗替尼组相比，抑制剂组细胞生长受抑，细胞迁移、侵袭能力及TGF -β1、p -Smad3、N -cadherin 、Vimentin 、FN 蛋白表达进一步降低（P 均<0.05），Smad7和E -cadherin 蛋白表达进一步升高（P 均<0.05）。

结论　安罗替尼可能通过介导
TGF -β1/Smads 通路的信号转导抑制人胃癌AGS 细胞迁移、侵袭和EMT 进程。

关键词：胃癌；安罗替尼；转化生长因子-β1/Smads 信号通路；细胞迁移；细胞侵袭doi ：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.34.009
中图分类号：R735.2 文献标志码：A 文章编号：1002-266X （2023）34-0043-04
Effects and mechanism of anlotinib on migration and invasion of human gastric cancer cells DENG Shuangnian 1， LI Juan ， LI Hui
1 Department of Oncology ， Linfen People's Hospital ， Linfen 041000， China
Abstract ： Objective To investigate the effects and mechanism of anlotinib on the migration and invasion of human
gastric cancer cells. Methods Human gastric cancer AGS cells were cultured in vitro ， and the AGS cells of the 3rd gen‑eration in the logarithmic growth phase were selected. They were divided into the control group （no intervention ）， experi‑mental group （2 µmol /L anlotinib group ， 4 µmol /L anlotinib group ， and 8 µmol /L anlotinib group ） and inhibitor group ［4 µmol /L anlotinib+10 µmol /L transforming growth factor -β1（TGF -β1
）/Smads signaling pathway inhibitor LY2109761］， which were all treated for 24 h. In order to avoid interference with the experiment of too much cell death ， in the inhibitor group ， we selected 4 µmol /L anlotinib as the optimal concentration and added 10 µmol /L TGF -β1/Smads pathway inhibi‑tor LY2109761 for follow -up study. Cell viability ， cell morphology ， migration ， invasion ， and expression levels of epitheli‑
al mesenchymal transformation （EMT ） and transforming growth faction -β1 （TGF -β1） /Smads signaling pathways were ana‑
lyzed by CCK -8， inverted microscopy ， Transwell chamber ， and Western blotting. Results Compared with the control group ， the cell viability of the 4 and 8 µmol /L anlotinib groups decreased （both P <0.05）. In the experimental group ， the
growth of AGS cells was inhibited ， and the migration and invasion ability and the expression of TGF -β1， p -Smad3， N -cad‑herin ， Vimentin and fibronectin （FN ） decreased （all P <0.05）， and the expression of Smad7 and E -cadherin protein in‑
creased ， with a dose -dependent manner （all P <0.05）. Compared with the 4 µmol /L anlotinib group ， the cell growth was
inhibited ， the cell migration and invasion abilities and the protein expression levels of TGF -β1， p -Smad3， N -cadherin ， Vimentin and FN further decreased in the inhibitor group （all P <0.05）， while the protein expression levels of Smad7 and E -cadherin further increased （both P <0.05）. Conclusion Anlotinib can inhibit the migration ， invasion and EMT pro‑cess of AGS cells in human gastric cancer by mediating TGF -β1/Smads pathway signal transduction.
Key words ： gastric carcinoma ； anlotinib ； transforming growth factor -β1/Smads signaling pathway ； cell migration ；
· 基础研究 ·
开放科学（资源服务）
标识码（OSID ）
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cell invasion
胃癌发病隐匿，早期临床症状不明显，确诊时多进展为晚期。

该病通常以手术治疗为主，但术后肿瘤仍有较高复发率和转移率，预后极差，对患者的生活质量影响较大［1］。

安罗替尼是一种口服多靶点酪氨酸激酶抑制剂，研究发现，其可通过多种与肿瘤细胞生长相关的信号通路实现对肿瘤细胞的直接抑制，同时安罗替尼还具有抗肿瘤血管生成的作用［2-4］。

转化生长因子-β1（TGF-β1）/Smads信号通路与肿瘤细胞生长、转移及上皮间质转化（EMT）等生理过程密切相关［5］。

研究表明Smad7可抑制TGF-β1对Smad3的磷酸化，对TGF-β1/Smad信号通路起负反馈调节作用［6］。

目前安罗替尼通过TGF-β1/Smads 信号通路作用胃癌的机制尚不完全明确。

2020年5月—2022年5月，我们探讨了安罗替尼对胃癌细胞
AGS迁移和侵袭的影响及机制。

1 材料与方法
1.1　材料　人胃癌AGS细胞，购自上海中科院细胞库。

安罗替尼（货号：S8726，美国Selleckchem公司），TGF-β1/Smads通路抑制剂LY2109761（货号：S49933，上海源叶生物科技有限公司），胎牛血清（货号：110.11-8611，上海四季青生物科技有限公司），RPMI 1640培养基（货号：C11875500BT，美国Gibco 公司），RIPA裂解液（货号：P0013B，上海碧云天生物科技有限公司），活细胞计数（CCK-8）试剂盒（货号：A311-01，南京诺唯赞生物科技有限公司），鼠抗人［TGF-β1（货号：MAB1835，美国R&D公司）、p-Smad3（货号：HK3086，美国CST公司），Smad3、Smad7、E-钙黏蛋白（E-cadherin）、N-钙黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纤维黏连蛋白（FN）及β-actin一抗（货号分别为66516、66478、60335-1、66219-1、60330-1、66042-1，武汉三鹰生物科技有限公司）］、辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG（二抗）（货号：SA00001-1，武汉三鹰生物科技有限公司）。

二氧化碳培养箱（MCO18AIC，日本三洋电机公司），倒置荧光显微镜（MF52-N，广州市明美光电技术有限公司），酶标仪（IMARK，美国BIO-RAD公司），凝胶成像系统（FluorChem HD2，美国Proteinsimple公司）等。

1.2　人胃癌AGS细胞培养与传代　于液氮中取胃癌AGS冻存细胞进行复苏后，37 ℃、5% CO2条件下在RPMI 1640培养基中培养，待细胞贴壁至80%~90%时进行细胞传代，取第3代对数生长期AGS细胞。

1.3　细胞分组及干预　将细胞分为对照组、实验组
和抑制剂组，对照组细胞不干预，实验组（2 µmol/L 安罗替尼组、4 µmol/L安罗替尼组、8 µmol/L安罗替尼组）分别给予2、4、8 µmol/L安罗替尼。

本研究中从4 µmol/L安罗替尼组开始细胞活力与对照组相比降低，为避免细胞死亡太多干扰实验，抑制剂组选择在4 µmol/L安罗替尼基础上加入10 µmol/L
TGF-β1/Smads通路抑制剂LY2109761进行干预，每组设3个复孔，后置于37 ℃、5% CO2条件下培养。

1.4　人胃癌AGS细胞活力的测定　采用CCK-8法。

细胞分组与给药方法同1.3，收集对数期生长细胞，调整密度至2×105/mL，将其接种到96孔板中，每孔加细胞悬液100 µL，实验重复3次。

各组干预24 h后，加入CCK-8溶液10 µL孵育2 h后，使用酶标仪测定各组OD值（450 nm），每组检测3次。

细胞
活力（%）=OD
（实验组或抑制剂组－空白组）
/OD
（对照组－空白组）×100%。

1.5　人胃癌AGS细胞形态观察　细胞分组与给药方法同1.3，取各组干预24 h的AGS细胞，倒置显微镜下观察细胞形态并拍照记录。

1.6　人胃癌AGS细胞的迁移和侵袭能力测定　采用Transwell小室法。

细胞分组与给药方法同1.3，取Transwell小室，在上室中加入无血清细胞悬液0.25 mL，调整密度为1×105/mL，下室加入0.45 mL 含10%胎牛血清的培养基。

24 h后，弃上清，PBS清洗3次，用4%甲醇固定30 min后进行晾干处理，0.1%结晶紫染色10 min，PBS清洗3次，在细胞侵袭能力分析实验时，小室用基质胶预处理，其他步骤相同。

将Transwell小室倒置于显微镜上，每孔随机选5个不同区域，用显微镜观察拍照。

每孔随机选5个不同区域。

Image J图像分析软件计算迁移或侵袭细胞数。

1.7　人胃癌AGS细胞中EMT和TGF-β1/Smads信号通路相关蛋白表达检测　采用Western blotting 法。

细胞分组与给药方法同1.3，干预24 h时，收集各组细胞，提取蛋白后定量，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶电泳，转膜，封闭2 h后参照抗体说明书加入一定稀释比例的一抗（TGF-β1、Smad3、p-Smad3、Smad7、E-cadherin、N-cad‑herin、Vimentin、FN及β-actin），4 ℃孵育过夜，次日TBST洗涤后加入山羊抗鼠IgG二抗，孵育2 h，洗涤3次，最后加入显影液，使用凝胶成像系统拍照记录。

蛋白灰度值用G表示，蛋白相对表达量= G目的蛋白/G内参蛋白（β-actin）。

1.8　统计学方法　采用SPSS23.0统计软件。

计量资料符合正态分布以xˉ±s表示，多组间比较采用单
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因素方差分析，多组间两两比较采用Tukey检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1　各组人胃癌AGS细胞活力比较　干预24 h 后，对照组、2 µmol/L安罗替尼组、4 µmol/L安罗替尼组、8 µmol/L安罗替尼组、抑制剂组细胞活力分别为1.00 ± 0.07、0.89 ± 0.04、0.76 ± 0.06、0.60 ± 0.08、0.52 ± 0.02。

与对照组相比，2 µmol/L安罗替尼组AGS细胞活力差异无统计学意义（P>0.05）；4、
8 µmol/L安罗替尼组细胞活力降低，呈剂量依赖性（P均<0.05）。

本研究中4、8 µmol/L安罗替尼组细胞活力与对照组相比差异有统计学意义（P均< 0.05），为避免细胞死亡太多干扰实验，后续实验中选取安罗替尼4 µmol/L作为最适浓度加入10 µmol/L TGF-β1/Smads通路抑制剂LY2109761作为抑制剂组进行干预。

与4 µmol/L安罗替尼组相比，抑制剂组细胞活力降低（P<0.05）。

2.2　各组人胃癌AGS细胞生长情况　人胃癌AGS 细胞处理24 h后，对照组细胞生长状态良好，实验组和抑制剂组细胞生长受到抑制，贴壁能力下降，细胞数量明显减少，形状变为不规则状态且细胞碎片增多。

见图1。

2.3　各组人胃癌AGS细胞迁移能力比较　干预24 h后，对照组、2 µmol/L安罗替尼组、4 µmol/L安罗替尼组、8 µmol/L安罗替尼组、抑制剂组细胞迁移数分别为（220.67 ± 27.50）、（166.67 ± 15.01）、（110.33 ± 16.62）、（88.33 ± 16.04）、（28.33 ± 7.02）个。

与对照组相比，实验组迁移细胞数明显减少。

与对照组相比，实验组细胞迁移数降低（P< 0.05），且呈剂量依赖性；与4 µmol/L安罗替尼组相比，抑制剂组细胞迁移数进一步降低（P<0.05）。

2.4　各组人胃癌AGS细胞侵袭能力比较　干预24 h 后，对照组、2 µmol/L安罗替尼组、4 µmol/L安罗替尼组、8 µmol/L安罗替尼组、抑制剂组细胞侵袭数分别为（215.00 ± 26.51）、（160.00 ± 18.52）、（107.33 ± 17.04）、（87.33 ± 9.45）、（26.33 ± 6.66）个，与对照组相比，实验组侵袭细胞数明显减少（P< 0.05）。

与对照组相比，实验组侵袭数降低（P< 0.05），呈剂量依赖性；与4 µmol/L安罗替尼组相比，抑制剂组细胞侵袭数进一步降低（P<0.05）。

2.5　各组人胃癌AGS细胞中EMT相关因子蛋白表达比较　见表1。

2.6　各组人胃癌AGS细胞中TGF-β1/Smads信号通路蛋白表达比较　见表2。

3 讨论
胃病发病原因主要有不良饮食习惯与饮食结构、慢性幽门螺旋杆菌感染等［7］。

早、中期的胃癌可以通过手术治疗加之以放、化疗，
提高患者生存率，注：2 μmol/L、4 μmol/L和8 μmol/L分别代表2 μmol/L安罗替尼组、4 μmol/L安罗替尼组和8 μmol/L安罗替尼组。

图1　各组AGS细胞生长情况
表1　各组AGS细胞中EMT相关因子蛋白表达比较（xˉ±s）
组别
对照组
2 µmol/L安罗替尼组4 µmol/L安罗替尼组8 µmol/L安罗替尼组抑制剂组E-cadherin
0.30 ± 0.01
0.80 ± 0.02*
1.20 ± 0.07*
1.40 ± 0.03*
1.42 ± 0.05#
N-cadherin
1.50 ± 0.04
1.20 ± 0.07*
1.12 ± 0.05*
0.81 ± 0.03*
0.70 ± 0.01#
Vimentin
1.33 ± 0.05
1.20 ± 0.04*
1.10 ± 0.05*
0.51 ± 0.03*
0.10 ± 0.01#
FN
0.90 ± 0.02
0.50 ± 0.03*
0.40 ± 0.02*
0.20 ± 0.01*
0.05 ± 0.01#
注：与对照组相比，*P<0.05；与4 µmol/L安罗替尼组相比，#P<0.05。

表2　各组AGS细胞中TGF-β
1
/Smads信号通路蛋白表达比较（xˉ±s）
组别
对照组
2 µmol/L安罗替尼组4 µmol/L安罗替尼组8 µmol/L安罗替尼组抑制剂组
TGF-β1
1.30 ± 0.08
1.10 ± 0.06*
0.90 ± 0.07*
0.20 ± 0.04*
0.10 ± 0.02#
Smad3
1.00 ± 0.09
1.01 ± 0.08
1.02 ± 0.05
1.04 ± 0.06
1.03 ± 0.05
p-Smad3
1.20 ± 0.02
1.02 ± 0.07*
0.90 ± 0.05*
0.35 ± 0.04*
0.21 ± 0.04#
Smad7
0.91 ± 0.03
1.04 ± 0.07*
1.10 ± 0.07*
1.31 ± 0.05*
1.51 ± 0.06#
注：与对照组相比，*P<0.05；与4 µmol/L安罗替尼组相比，#P<0.05。

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但多半患者就诊时已发展为晚期，通过手术较难根治。

研发更具安全性与疗效药物来抑制癌细胞转移是胃癌治疗的热点和难点［8］。

近年来诸多学者对安罗替尼进行的研究表明，其不仅能抑制肺癌细胞生长，对其他肿瘤的生长也同样发挥抑制作用［9］。

杨斌等［10］对肝内胆管上皮肿瘤细胞的研究发现，安罗替尼对HCCC-9810细胞具有杀伤作用，可以抑制细胞的侵袭和转移。

张元元［11］研究表明安罗替尼治疗胃癌的作用及抑制胃癌迁移及侵袭机制可能是由于安罗替尼通过下调淋巴管生成因子表达的水平发挥作用。

以上研究提示，安罗替尼可调控多种肿瘤的发生发展，与癌细胞转移关系密切，可为本实验的开展提供理论支撑，为治疗胃癌开辟一种新的途径。

这些研究提示安罗替尼对胃癌的发生发展具有抑制作用。

本研究结果显示，与对照组相比，4、8 µmol/L 安罗替尼组中人胃癌AGS细胞活力明显降低，实验组中经不同浓度安罗替尼处理后细胞生长均受到抑制，表明安罗替尼可以抑制人胃癌AGS细胞的生长。

实验组中人胃癌AGS细胞迁移和侵袭能力下降，表明安罗替尼可以抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。

实验组与对照组相比，E-cadherin蛋白表达升高，N-cadherin、Vimentin和FN蛋白表达降低。

提示安罗替尼可抑制胃癌细胞的迁移、侵袭及EMT 进程。

TGF-β1/Smads通路作为经典的信号传导通路，参与多种肿瘤细胞的生长、迁移及侵袭等过程［12］。

EMT的发生发展与TGF-β1/Smads信号通路密切相关。

EMT现象广泛存在于消化系统肿瘤中，且在癌细胞的浸润转移中发挥重要作用。

TGF-β1/Smads 信号通路与胃癌关系较为密切，陈春苗等［13］研究发现，小檗碱通过TGF-β/Smad通路能调控胃癌细胞的迁移及EMT进程。

魏良煜［14］研究表明，安罗替尼能调控TGF-β1和EMT相关蛋白Vimentin表达。

本研究中4、8 µmol/L安罗替尼组与对照组相比，细胞活力出现明显降低趋势，为避免细胞死亡太多干扰实验，选取安罗替尼4 µmol/L作为最适浓度加入10 µmol/L TGF-β1/Smads通路抑制剂LY2109761进行TGF-β1/Smads通路验证。

结果发现，与4 µmol/L 安罗替尼组相比，抑制剂组细胞生长进一步受到抑制，细胞活力、迁移、侵袭能力及TGF-β1、p-Smad3、N-cadherin、Vimentin、FN蛋白表达降低，E-cadherin 和Smad7蛋白表达升高。

上述结果表明安罗替尼抑制人胃癌AGS细胞的迁移、侵袭通过介导TGF-β1/ Smads通路信号转导，干预其EMT进程发挥作用。

综上所述，安罗替尼可抑制人胃癌AGS细胞迁移和侵袭，其作用机制与介导TGF-β1/Smads信号通路进而干预EMT进程有关。

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（收稿日期：2023-07-13）
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