石油烃降解菌的初筛及其降解性能研究

through identification of molecular biology. No.8 bacterium can effectively improve the biodegrading capacity of
SBR with activated sludge. The removal rate of COD is 90% aboved.
1.4 DCIP 显色实验
DCIP 筛选降解菌的原理是：DCIP（2，6- 二氯吲 哚酚钠，C12H7NCl2O2）为蓝色化合物，是一种氧化还 原指示剂，起初被用于研究植物的光合作用和维生 素含量的测定。DCIP 氧化态为蓝色，还原态为无色。
分子中心的 N 原子可接受电子，使 N=C 双键变为 N- C 单键，双键的改变带动 了 环 的 结 构 变 化 ，而 DCIP 结构的改变会引起吸收广波长的变化，溶液颜 色进而从深蓝色变为无色，其化学反应式如下：
1.3 细菌的分离和纯化
种子液的制备：在体系为 50mL 的培养基中，按 接种量为 5%的比例接种海洋钻井废水基泥浆，在 温度为 30℃，摇床速率为 120r·min-1 条件下连续过 夜培养，以每 7 天传代一次计，共传代 3 次。细菌的 分离和纯化：采用稀释涂平板法对水基泥浆废弃物 中的菌株进行培养、分离和纯化，具体操作步骤如 下：
污泥复配后发现 8 号菌能够有效提升 SBR 系统的生物处理能力，COD 去除率达到 90%以上。
关键词：石油烃；降解菌；废水基泥浆；COD；TOC
中图分类号：TE622.1
文献标识码：A
Isolation of hydrocarbon degrading bacteria and research on their degrading performance*
实验用水基泥浆废水样制备方法为：称取底泥 5.1813g 于烧杯中，加入 200mL 去离子水，然后将泥 浆液搅拌均匀后移入 1000mL 容量瓶中，并反复润 洗烧杯，最后加水稀释至标线。
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杨丞磊等：石油烃降解菌的初筛及其降解性能研究 *
2010 年第 3 期
1.2 培养基的制备
实验中需要对细菌进行富集培养以便对所需
1.6 单菌摇瓶培养
将预先配制好的水基泥浆水样移取 27mL 至 100mL 三角瓶中，加入 0.1g NaH2PO4，0.2g 蛋白胨， 0.2g NH4Cl，取样并分析此刻体系的 COD 和 TOC 值并做好记录。接下来将摇瓶在 115℃左右的温度 下灭菌 3h 后取出冷却至室温，再进行分离菌株的 接种，接种量为 3mL 菌液，接种操作均为无菌操作。 将 接 种 后 的 摇 瓶 置 于 恒 温 水 浴 锅 内 ，在 25 ℃ ， 114r·min-1 的条件下培养 7d。培养完毕后将摇瓶内 的溶液进行离心分离，转速为 2000r·min-1，共离心 5min，离心后将上清液取出，撇去残留菌体，测定上 清液的 COD 和 TOC，并计算 COD 和 TOC 去除率进 而评价接种细菌对石油烃的降解能力。
摘 要：本文以柴油和石蜡混合物为碳源，利用液体培养基富集培养石油烃类降解菌。得到的菌液通过
DCIP 显色实验和原油模拟降解实验初步筛选出 13 株降解菌菌株，并经过分子生物学的鉴定大部分为不动杆
菌属和假单胞菌属。经过摇瓶培养后，HY- 3、G6 和 8 号菌对于 COD 和 TOC 的去除效果较好，并通过和活性
菌株进行分离和纯化。所使用的富集培养基采用液 体培养基，具体成分见表 1。
表 1 富集培养基的成分 Tab.1 Components of enrichment medium
试剂 K2HPO4 NaH2PO4 MgSO·4 7H2O CaCl2 NaCl 柴油石蜡混合物（1∶1）
含量 /% 0.08 0.04 0.02 0.01 0.02 2
Key words: petroleum hydrocarbons；degrading bacteria；waste water-based drilling mud；COD；TOC
在海洋石油开采作业中，钻井液是十分重要的 物质，它能够起到携带和悬浮岩屑、稳定井壁和平 衡地层压力、冷却和润滑钻头、钻具和传递水动力 的作用[ 1 ]。随着钻井液体系的不断发展，钻井液中使 用了大量的化学添加剂，同时钻井过程中无法避免 油层原油混入钻井液，从而导致钻井废弃物中含有 大量的石油烃以及有机污染物。这类废弃物随着钻 井作业被带到地面，长期堆放或者任意排放将对水 相和陆相环境造成危害[ 2 ]。钻井废弃物中，废泥浆的 油含量比较高[3 ]，石油烃是主要的污染物质之一，此 外，还有各种有机高分子化学助剂，重金属和无机
2. China Oilfield Services Limited, Beijing 100010, China）
Abstract: The petroleum hydrocarbon degrading bacteria were cultured in the liquid medium by using diesel
oil and paraffin as carbon resource in this paper. The 13 bacteria have been isolated initially through DCIP experi－
ment and oil degradation experiment. The most bacteria are proved to be Acinetobacter and Pseudomonas species
YANG Cheng-lei1，LUO Yu-wei2，CHEN Ping2，ZHU Zhan-bing2，XIANG Xian-zhong2，YANG Zhi-xun1，LU Jun1
（1.East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China；
盐类污染。因此，钻井废弃物必须经过无害化处理 才能够进行排放。
1 材料与方法
1.1 钻井废弃物原料
本实验中研究的钻井废弃物来自于中海油平 湖八角亭 B01 号井的废水基泥浆，其外观看上去呈 褐色，整体上为较为黏稠的膏状物，流动性较差。经 测定，每克该废水基泥浆化学需氧量为 192.453mgO2， 水基泥浆的 COD 浓度为 193000mg·kg-1 泥浆，BOD5 为 39000mg·kg-1 泥浆，BOD5/COD 约为 0.2，属于较 难生物降解。水基泥浆的油含量为 42256mg·kg-1 泥 浆，是水基泥浆的主要污染物。经 GC- MS 分析，测得 的 22 种有机成分多以长链烷烃为主，包括 C10~C24，属 于较难生物降解物质。
整个稀释涂平板实验的结果见图 2。
左边：废水基泥浆（10- 10），右边：炼油废弃物（10- 9）
图 2 稀释涂平板结果 Fig.2 Result of spread-plate technique Left: wasted water-based drilling mud（10-10），
right: the waste of refining（10-9）
C12H7NCl2O2（blue）+ 2H+ + 2e- = C12H9NCl2O2（colorless）
C12H7NCl2O2（blue）+ VitC = C12H9NCl2O2（colorless）
由于微生物降解烃类物质的过程中存在电子 转移现象，故 DCIP 可作为电子受体，接受来自烃降 解过程中的电子。如果有电子转移，则会引起 DCIP 中双键结构的重新分配，引起溶液颜色的变化，所以 可以根据溶液颜色的变化来判断有无石油烃类降 解菌的存在。
（1）培养基的制备：培养基的制备见表 1。 （2）接种液梯度稀释方法：称取 5g 废水基泥浆 于三角瓶内，然后加入 45mL 无菌去离子水，经过充 分振荡 10min 之后即为稀释 10-1 倍的泥浆悬浊液。 接着，准备好若干支无菌试管，均预先加入 9mL 无 菌水。将先前准备好的泥浆悬浊液振荡后再静置 30s，然后吸取 1mL 该悬液加入准备好的无菌试管内 并振荡混匀，所用吸管在移取悬液时要反复轻轻吹 吸数次，此时得到的即为 10-2 倍稀释液。按照本方 法可以陆续将悬液稀释 10-3、10-4、10-5 倍等需要的 稀释倍数。 （3）制平板操作：取一无菌吸管，以无菌操作的 方法吸取实验所需稀释倍数的接种液 0.1mL 于培养 皿中，然后水平轻轻转动培养皿，使菌液和培养基 充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，再进行使用接 种环划线，划线完毕后放入恒温培养箱，在 30℃下 培养 24h。通过稀释涂平板实验，最终挑取不同形态 的细菌作为后续实验的菌株。
收稿日期：2010-01-25 基金项目：上海市重点学科基金资助项目（B506） 作者简介：杨丞磊（1982-），男，助教，华东理工大学在读硕士研究
生；2005 年 6 月毕业于华东理工大学，工学学士，现为华 东理工大学资源与环境工程学院能源化工系教师，从事教 学管理工作。 导师简介：鲁 军（1949-），男，教授，博士生导师，华东理工大学研究 生院副院长兼“211 工程”与学科建设办公室主任，研究方 向：污染控制与技术开发和能源洁净转化技术研究。
1.5 原油模拟降解实验
将经过 DCIP 显色实验筛选得到的降解菌菌液 进行原油模拟降解实验，考察降解菌落对烃类物质 的降解功效。实验中将初步筛选所得到的降解菌菌 液接种到含有原油的无机盐培养基中。降解菌的接 种量为 10%，以灭过菌的大庆原油作为唯一的碳 源，其含量为 2%，总的培养体系为 50mL，在 30℃， 120r·min-1 的条件下摇瓶培养 5d。第二阶段摇瓶培 养采用柴油作为细菌生长的唯一碳源，摇瓶培养体 系的体积减少为 30mL，其中菌液接种量还是 10%， 培养体系中含有 2%的柴油。将摇瓶在 30℃，120r· min-1 条件下恒温培养 5d。
2 结果与讨论
2.1 烃类降解菌富集培养
富集培养的结果见图 1 所示。实验结果表明，
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杨丞磊等：石油烃降解菌的初筛及其降解性能研究 *
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酵母粉的加入对种子液的富集有一定的影响。当培 养基中不含酵母粉时，传代 3 次后培养液变为红 色，与加入酵母粉的培养基有明显的颜色差别，加入 酵母粉的种子液培养后溶液较为澄清，同时出现团 状絮体。这是由于酵母膏是一种非常容易被细菌利 用的营养物，当培养基中加入酵母粉后，所有的细 菌都可以利用酵母粉作为生长的底物，其中没有降 解能力的杂菌生长繁殖比较旺盛，甚至超过了实验 需要富集的降解功能菌群，使得降解菌生长受到抑 制。而在第 2 个三角瓶中没有加入酵母粉，只是加 入了等比例的柴油和石蜡混合物作为细菌生长的 唯一碳源，所以只有那些能够利用柴油或石蜡作为 碳源的细菌才能生长和繁殖，其他不能有效利用柴 油和石蜡作为碳源的细菌在反复传代后逐渐消亡。 因此，培养基溶液变成红色是一种有效的筛选方 法，可以明确指示出降解菌消耗柴油和石蜡以后， 代谢产生的红色物质逐渐增多，说明降解菌的浓度 也逐渐增高，从而实现降解菌培养的目的。
Sum 174 No.3
化学工程师 Chemical Engineer
文章编号：1002-1124（2010）03-0019-06
科
研
与
石油烃降解菌的初筛
开
发
及其降解性能研究 *
2010 年第 3 期
杨丞磊 1，罗宇维 2，陈 平 2，朱战兵 2，项先忠 2，杨知勋 1，鲁237；2.中海油田服务股份有限公司，北京 100010）
从左到右依次为：1.含酵母粉 2.不含酵母粉 图 1 传代 3 次后的培养结果
Fig.1 Result after enrichment culture From left to right: （1.Yeast powder added；2.Without yeast powder）
2.2 降解菌落的初步筛选