细胞培养技术及常见问题

• 储存和使用 ＊热灭活 高质量的胎牛血清不必热灭活，但 培养ES细胞、平滑肌细胞时建议热灭活。 ＊分装为小包装，储存于-20°C，避免反复冻 融。 ＊使用浓度，一般为5%~20%，常用10%。。 • 缺点 ＊过多添加血清，可能使细胞发生变化。 ＊血清中某些物质可能对细胞有毒性作用。 ＊不同批号血清之间质量有差异。 7、促贴壁物质 • 鼠尾胶、明胶、FN等。制作时严格无菌操作。
细胞培养技术及常见问题
复旦大学附属中山医院 中国生物医药技术服务中心
※实验室细胞培养技术
一、细胞培养的设备条件
• 无菌室 密闭性好，方便消毒；干燥透气，但工 作时和外界无空气对流。 • 超净工作台 • CO2培养箱 定期清洁消毒，保持湿度。
• 培养器皿的清洗与消毒 浸酸6小时以上→流水 冲洗15次→双蒸水浸洗3次→烘干、包装→消毒。
2、消化液 • 胰酶 常用0.1%~0.25%，PH8~9 • EDTA溶液 抑制二价离子，破坏细胞间连接， 适用于贴壁较牢的细胞。可与胰酶混合后使用， 使用浓度为0.02%，配制时加碱助溶。 • 胶原酶溶液 作用对象是胶原组织，不损伤细 胞，常用于原代培养。使用浓度为0.1~0.3mg/L， 或20万U/L，PH 6.5。 3、pH调整液 • 5.6%NaHCO3溶液 • HEPES液 增强培养基的PH缓冲能力
七、原代培养方法 1、组织块法 → 血管平滑肌细胞 2、胰酶消化法 • 冷消化法 → 骨骼肌成肌细胞 组织块→4℃胰酶中浸泡过夜→37℃消化20分 钟→收集细胞 • 热消化法→乳鼠心肌细胞 组织块→37℃胰酶中分次消化，每次10~15分 钟，并低速机械搅拌→收集细胞 3、胶原酶消化→上皮类细胞 • 胶原酶工作浓度：50~200U/ml • 加入3mM的CaCl2可增加消化效率。
• F12培养基 适合单细胞分离培养及无血清培养。 • McCoy’s5A培养基 特别适合原代细胞及较难 培养细胞的生长。 四、其他培养用液 1、平衡盐溶液 • D-Hank’s液不含Ca2+、Mg2+离子，适合于配制 胰酶溶液。 • Hank’s液在5%CO2环境中会迅速变酸，不能放 入CO2温箱。
6、血清 牛血清适用于大多数哺乳类动物细胞 • 可分为 ：小牛血清、新生牛血清、胎牛血清 • 质量标准 可向厂家索取质检报告 ＊总蛋白含量：不低于35~45g/L ＊球蛋白含量：﹤20g/L，越低越好 ＊血红蛋白含量：越低越好 • 外观：土黄或棕黄色，清凉透明，无或少许沉 淀，粘稠。 ＊大量沉淀物：污染或蛋白变性 ＊颜色为棕红色：血红蛋白含量高，有溶血 ＊液体稀薄：掺入的生理盐水过多
五、污染的预防和排除
1、预防
• 严格遵守无菌操作规程，不抱任何侥幸心理。
• 配制的液体、分装的血清，每批都必须随机抽 取样本做无菌试验，确认无菌才可投入使用。 • 及时冻存状态良好的细胞，以备不时之需。 • 培养试剂和操作器械要专人专细胞专用。 • 每次传代时留一瓶作备用，当传代细胞生长正 常时再丢弃。
3、抗生素 • 青-链酶素双抗 预防G+、G-菌，青霉素使用 浓度为10万U/L，链霉素为0.1g/L。 • 可加入卡那霉素预防支原体污染。 • 加入两性霉素抑制霉菌。 • 稳定性差，只有3~5天。 • 需做剂量反应实验，确定抗生素对培养细胞产 生毒性的剂量水平。 4、谷氨酰胺补充液 • 易降解，临用前添加。使用浓度为0.002mol/L。
六、细胞的冻存和复苏 1、冻存 • 冻存液 7份培养液、2份FBS、1份DMSO或甘 油。 • 细胞密度 （1~10）×106个/ml • 步骤 4℃30分钟→-80 ℃24小时→液氮 • 冻存细胞应选取处于对数生长期的细胞。 2、复苏 • 液氮中取出的细胞应马上放入37 ℃水浴中，快 速摇晃融化。 • 0.4%台盼蓝染色，检测细胞存活率。
2、污染的排除 • 及时高压灭菌污染的细胞，然后丢弃。（首选） • 对于污染较轻，且来源困难的高价值细胞
（1）用无抗培养基传代细胞，接种于多孔板中 （2）将浓度梯度稀释后的抗生素加入孔内，例如，两性 霉素B推荐下列浓度：0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、 8.0mg/ml。 （3）每天观察细胞毒性指标，如脱落、空泡、变圆等。 （4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2~3倍 浓度的抗生素培养液培养细胞2~3代。 （5）在无抗培养基中传代一次。 （6）重复步骤4 （7）在无抗培养基中培养4~6代，确定污染已被消除。
三、培养基的选择和使用 • MEM 成分简单，贴壁细胞首选。 • DMEM 分高糖型和低糖型。 • IDMEM 适合细胞密度低，生长困难的细胞。 如杂交细胞的筛选，DNA转染后转化细胞的筛 选培养。 • RPM1640 应用最广泛的培养基之一。悬浮细 胞培养首选，主要针对淋巴细胞，也适合其他 细胞。 • 199、109培养基 成分齐全，培养效果较好。 • F10培养基 适合小鼠及人类二倍体细胞培养。
4、灌流法→血管内皮细胞、成年动物心肌细胞 培养 • 胰酶、胶原酶可以单独或混合使用 5、密度梯度离心法→淋巴细胞、单核细胞培养 • Ficoll • Percoll 可以得到较纯的单核细胞 • 分离液成分为多糖复合物，可能与细胞表面受 体结合，影响后续实验结果。
※如何收集细胞进行实验检测
1、应该选用处于对数生长期，状态良好的细胞 用于实验。 2、细胞应处于70%左右融合，形态饱满，折光性 好。提前24小时换无血清培养基，避免血清 干扰，控制细胞生长速度。 3、选择适当的分离液，避免所分离的细胞表面 受体和其他标记分子被遮盖。 4、酚红有类似雌激素作用，为避免类固醇反应， 某些检测使用的细胞要用不加酚红的培养基。
二、பைடு நூலகம்养基基本要求
1、营养成分 • 氨基酸 12种必须氨基酸，或需要添加谷氨酰胺。 • 单糖 葡萄糖吸收最高，半乳糖最低。神经元培养 需另外添加。 • 维生素 • 无机盐及微量元素 2、促生长因子和激素 3、渗透压 260~320mOsm/kg范围内都适宜。 4、PH 7.2~7.4 5、必须使用三蒸去离子水