蛋白质一般的纯化流程(共15张PPT)
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持膜內外電位差平衡h移在冰浴中加入烘乾並磨碎的ammoniumsulfate至飽和度為60取50ml待Байду номын сангаас化之蛋白質攪拌15分鐘後以9000xg離心15min取出沉澱物並標示鹽析濃度上清液重複上述步驟作ammoniumsulfate至飽和度100分別取出其沉澱物準備透析沉澱物以buffer溶解將溶液置于透析管中在001mph7的phosphatebuffer中進行4透析隔夜
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
Ammonium Sulfate % Saturation (p.
Purification(純化)
作ammonium sulfate
如何計算純化效率？
酵素專一活性
（Enzyme Specific Activity) U/μg
U: Enzyme Activity μg : Protein mass
鹽析（Salting Out)
protein concentration of quantitation enzyme activity test protein concentration of quantitation
蛋白質初步萃取
陽離子（Na＋）移至膜，為維持膜內外電位差平衡，H＋移至膜內，可成引起蛋白質解離引起蛋白質變性。
protein concentration of quantitation enzyme activity test
純化與鑑定
Electrophoresis
(SDS PAGE、native PAGE、2D PAGE) western blotting
(immuno-detection、radio-detection)
透析進行
透析完成
Donnoan效應
• 離子移出附在透析膜引起膜內 外電位差
• 陽離子（Na＋）移至膜，為維 持膜內外電位差平衡，H＋移至
膜內，可成引起蛋白質解離引起
蛋白質變性。
鹽析
取50mL待純化之蛋白質
在冰浴中加入烘乾並磨碎的
ammonium sulfate至飽和度為60%
攪拌15分鐘後以9,000xg離心15min
Cellulose (mwco:3,500)
• 透析管處理： 出廠前：加抗真菌劑（NaCN) 使用處理:1%Na2CO3 ；1mMEDTA
煮沸15~20分鐘 影響因素：溫度、壓力
透析示意圖示意圖
Ammonium Sulfate % Saturation (p. (gel filtration、ion exchanger、affinity (gel filtration、ion exchanger、affinity Chromatography 煮沸15~20分鐘 protein concentration of quantitation 出廠前：加抗真菌劑（NaCN) amino acid sequence determination、structure determination、(X - ray etc. (gel filtration、ion exchanger、affinity salting out 、 dialysis 陽離子（Na＋）移至膜，為維持膜內外電位差平衡，H＋移至膜內，可成引起蛋白質解離引起蛋白質變性。 protein concentration of quantitation 作ammonium sulfate 蛋白質的初步純化和結果之 濃度測定及α-Amylase活性分析 protein concentration of quantitation
amino acid sequence determination、structure determination、(X - ray etc.)
蛋白質的初步純化和結果之 濃度測定及α-Amylase活性分析
B1 劉安庭 張馨方
B2 蔣宜珍 蕭君儀
enzyme activity test
salting out 、 dialysis
(gel filtration、ion exchanger、affinity
出廠前：加抗真菌劑（NaCN)
B1 劉安庭 張馨方
出廠前：加抗真菌劑（NaCN)
protein concentration of quantitation
(gel filtration、ion exchanger、affinity
蛋白質一般的純化流程
純化流程
Cell or organ lysis salting out 、 dialysis
protein concentration of quantitation enzyme activity test
Purification(純化)
Chromatography
(gel filtration、ion exchanger、affinity chromatography etc. HPLC)
取出沉澱物，並標示鹽析濃度
上清液重複上述步驟， 作ammonium sulfate
至飽和度100%
分別取出其沉澱物準備透析
透析
沉澱物以buffer溶解
將溶液置於透析管中
在0.01M 、pH=7的phosphate buffer中
進行4℃透析隔夜
溶解：溶質均勻分佈在水溶液中
鹽析（Salting Out)
利用鹽類與水的交互作用大於水與蛋白質 的交互作用將蛋白質沈降出來
Ammonium Sulfate
Ammonium Sulfate Fraction Ammonium Sulfate % Saturation (p. 31)
透析膜透析
• 透析管：Sectra / Por memebrance
Ammonium Sulfate % Saturation (p.
Purification(純化)
作ammonium sulfate
如何計算純化效率？
酵素專一活性
（Enzyme Specific Activity) U/μg
U: Enzyme Activity μg : Protein mass
鹽析（Salting Out)
protein concentration of quantitation enzyme activity test protein concentration of quantitation
蛋白質初步萃取
陽離子（Na＋）移至膜，為維持膜內外電位差平衡，H＋移至膜內，可成引起蛋白質解離引起蛋白質變性。
protein concentration of quantitation enzyme activity test
純化與鑑定
Electrophoresis
(SDS PAGE、native PAGE、2D PAGE) western blotting
(immuno-detection、radio-detection)
透析進行
透析完成
Donnoan效應
• 離子移出附在透析膜引起膜內 外電位差
• 陽離子（Na＋）移至膜，為維 持膜內外電位差平衡，H＋移至
膜內，可成引起蛋白質解離引起
蛋白質變性。
鹽析
取50mL待純化之蛋白質
在冰浴中加入烘乾並磨碎的
ammonium sulfate至飽和度為60%
攪拌15分鐘後以9,000xg離心15min
Cellulose (mwco:3,500)
• 透析管處理： 出廠前：加抗真菌劑（NaCN) 使用處理:1%Na2CO3 ；1mMEDTA
煮沸15~20分鐘 影響因素：溫度、壓力
透析示意圖示意圖
Ammonium Sulfate % Saturation (p. (gel filtration、ion exchanger、affinity (gel filtration、ion exchanger、affinity Chromatography 煮沸15~20分鐘 protein concentration of quantitation 出廠前：加抗真菌劑（NaCN) amino acid sequence determination、structure determination、(X - ray etc. (gel filtration、ion exchanger、affinity salting out 、 dialysis 陽離子（Na＋）移至膜，為維持膜內外電位差平衡，H＋移至膜內，可成引起蛋白質解離引起蛋白質變性。 protein concentration of quantitation 作ammonium sulfate 蛋白質的初步純化和結果之 濃度測定及α-Amylase活性分析 protein concentration of quantitation
amino acid sequence determination、structure determination、(X - ray etc.)
蛋白質的初步純化和結果之 濃度測定及α-Amylase活性分析
B1 劉安庭 張馨方
B2 蔣宜珍 蕭君儀
enzyme activity test
salting out 、 dialysis
(gel filtration、ion exchanger、affinity
出廠前：加抗真菌劑（NaCN)
B1 劉安庭 張馨方
出廠前：加抗真菌劑（NaCN)
protein concentration of quantitation
(gel filtration、ion exchanger、affinity