新疆传统酸奶中产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定

新疆传统酸奶中产胞外多糖乳酸菌的筛选与鉴定
薛艳蓉; 靳光; 王呈; 梁茂文; 赵瑞生; 刘波
【期刊名称】《《畜牧与饲料科学》》
【年(卷),期】2019(040)009
【总页数】4页(P109-112)
【关键词】新疆传统酸奶; 胞外多糖; 乳酸菌; 筛选; 鉴定
【作者】薛艳蓉; 靳光; 王呈; 梁茂文; 赵瑞生; 刘波
【作者单位】山西省农业科学院畜牧兽医研究所山西太原 030032
【正文语种】中文
【中图分类】TS252.54; TS201.3
胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是微生物在生长代谢过程中分泌到菌体外的多糖类化合物，在微生物生长代谢过程中起重要作用［1］。

在发酵过程中乳酸菌产生的一种多糖类物质，即为乳酸菌胞外多糖（EPS）。

研究资料表明，EPS 可赋予酸奶特殊的质构和口感，例如增加酸奶的黏度和流变性，提高酸奶的持水能力，防止乳清析出，改善酸奶的口感等［2］。

其次，因为其生物活性良好，能够降血糖，调节血压，以及调节机体的免疫功能，被应用于医药行业［3］。

目前，多种多糖已经应用于临床研究，研究其抗衰老、抗病毒、抗肿瘤等作用［4］。

近年来，胞外多糖已成为乳酸菌资源开发利用的研究热点，但是现在用于产胞外多糖的菌株产量低，菌株不稳定，成为阻碍其实际生产的主要因素，因此，筛选高产胞
外多糖的乳酸菌，优化培养条件，实现工业化生产将是未来研究方向。

自制传统酸奶作为新疆地区各少数民族的日常饮品，其中蕴含的乳酸菌群因地域、气候和制作习惯等不同，传统酸奶具有明显的差异性，而其乳酸菌资源的生物多样性是其他国家和地区所没有的［5］。

该研究从新疆传统酸奶中分离纯化出产胞外多糖的乳酸菌，并对其产胞外多糖含量进行测定，运用16S rDNA 测序法进行鉴定，从而选择产胞外多糖能力较高的菌株，丰富产胞外多糖乳酸菌发酵剂的种类。

1 材料与方法
1.1 材料与仪器
传统酸奶样品6 份，购买自6个新疆牧民家庭。

三氯乙酸、浓硫酸、95%乙醇、
苯酚均为国产分析纯试剂；细菌基因组提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；UV－752N 紫外可见分光光度计；立式高压灭菌锅（上海三申）；隔水
式电热恒温培养箱；BH200 电显微镜；GTC96S PCR 扩增仪，ABI 3730xl 测序仪；TGL-16G 离心机。

MRS 液体培养基和MRS-CaCO3 平板培养基。

图1 菌株菌落形态
1.2 试验方法
1.2.1 乳酸菌的活化：厌氧条件下，分别从6 份传统酸奶样品中取1 mL 接种于MRS 液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养24 h，连续培养3 次使乳酸菌恢复
活性。

1.2.2 传统酸乳中乳酸菌的分离纯化：厌氧条件下，在9 mL 无菌生理盐水中加入
活化后的乳酸菌1 mL，将乳酸菌培养液递减3个梯度，分别为10-4、10-5、10-6，各吸取稀释后的菌液0.1 mL 分别涂布于MRS-CaCO3 平板培养基，37℃、24～48 h 恒温静置培养，观察菌落特征，挑取有溶钙圈的菌落，再次接种于
MRS-CaCO3 平板培养基反复划线纯化，直至形成单个菌落。

1.2.3 产胞外多糖乳酸菌的筛选：在MRS 液体培养基中接种上述纯化后的单菌落，
37℃、48 h 静置培养。

观察菌落的特征，用无菌接种环挑取表面黏稠并有明显拉丝的单菌落，并对纯化菌株进行革兰染色、接触酶试验和凝乳试验，在显微镜下观察其细胞形态特征。

1.2.4 16S rDNA 基因序列分析：用细菌基因组DNA 提取试剂盒按照说明书操作
提取筛选得到的乳酸菌菌株DNA。

用通用引物P1 （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和P2（5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′）对提取到的基因组进行PCR 扩增，扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性
30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，30 次循环；72℃再延伸10 min。

PCR 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检验合格后送至山西兆恩因生物公司进行DNA
测序。

测定后的结果登录美国国立生物技术信息（National Center for Biotechnology Information，NCBI）进行Blast 比对，采用Mega 软件中的邻
接法（neighbor joining，NJ）构建系统发育树。

1.2.5 胞外多糖的提取：37℃恒温条件下，在MRS 液体培养基中培养筛选得到的
乳酸菌菌株；48 h 后，取10 mL 发酵液加80%三氯乙酸搅拌，离心去除蛋白，
收集上清液；在上清液中加3 倍体积的95%的乙醇，沉淀多糖，离心收集沉淀；
用蒸馏水溶解上述沉淀，透析48 h，得胞外粗多糖水溶液。

1.2.6 多糖含量的测定：采用苯酚—硫酸法测定多糖的含量［6］。

称取葡萄糖50 mg 于100 mL 容量瓶中，加水溶解；在新的100 mL 容量瓶中分别吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 溶解的葡萄糖溶液，加蒸馏水至2 mL，加入6%苯
酚1 mL 和浓硫酸5 mL，振荡摇匀，沸水浴中加热15 min 显色，冷却后用紫外
分光光度计测OD490 nm 处的吸光值，用水作为空白对照，制得标准曲线，横坐标为多糖微克数，纵坐标为OD490 nm 处的吸光值。

测定样品的OD490 nm 值，根据标准曲线获得多糖的含量。

图2 菌株镜检图
2 结果与讨论
2.1 产胞外多糖菌株的筛选
37℃厌氧条件下在MRS-CaCO3 平板培养基中获得菌落，菌落形态如图1 所示，菌落呈圆形，乳白色，表面凸起，边缘整齐，表面湿润光滑，黏稠能拉起很长的丝［7］。

将分离纯化得到的菌株进行革兰染色，结果显示呈阳性；接触酶实验呈阴性；能凝乳，根据这些特征初步判定为乳酸菌，菌落能够拉丝的菌株有4 株，如
图2 所示，在光学显微镜下观察，4 菌株均为革兰氏阳性菌，呈短杆状，单独或
成对存在，无芽胞，将得到的4 株菌分别标记为L1、L2、L3、L4。

图3 16S rDNA PCR 扩增产物电泳图
2.2 产胞外多糖菌株16S rDNA 序列分析
根据NCBI 中乳酸菌16S rDNA 序列构建进化树进行分析，4 株菌的基因组DNA 经PCR 扩增后测序，L1、L2 与菌株Lactobacillus casei 同源性最高，为100%，可将其鉴定为干酪乳杆菌；L3、L4与植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）处与同一分支相似度为99%，因此，鉴定为植物乳杆菌，如图4 所示。

图4 4 株菌株系统发育树
2.3 胞外多糖含量的测定
葡萄糖浓度标准曲线如图5 所示。

4 株乳酸菌L1、L2、L3、L4 测得的产胞外多糖含量依次为176、248、205、294 mg/L；由图6 可看出，L4 株产胞外多糖量最高，L1 株产量最低。

L1 与L2 株产胞外多糖检测结果显示都是干酪乳杆菌，L3 与L4 株是植物乳杆菌，但在产胞外多糖能力方面存在差异，4 株菌株分别来源于不
同样品，可见，同种菌株在不同环境中，生长代谢存在差异。

图5 葡萄糖浓度标准曲线
图6 不同菌株产胞外多糖含量
3 结论
新疆地区地理环境独特，牧民制作的传统酸奶历史悠久，使用传统方法经过长期自然选择，酸奶中微生物类群丰富，尤其蕴藏着大量的有益乳酸菌。

乳酸菌胞外多糖物理特性独特，又具有良好的流变学特性［8］。

从新疆地区6 份传统酸奶样品中分离出4 株产胞外多糖的乳酸菌，经过鉴定分别是2 株干酪乳杆菌和2 株植物乳
杆菌。

测定产胞外多糖的含量时发现，虽然是同一菌种，但因生长环境不同，所以产胞外多糖含量存在差异。

胞外多糖是微生物适应环境的产物［9］。

某些细菌、真菌和蓝藻类都能产生胞外多糖，可见胞外多糖的产生与菌种的遗传特性相关。

培养基的成分，如碳源、氮源等可以影响胞外多糖的产量，据报道，葡萄糖作为乳酸菌碳源时，胞外多糖产量明显高于其他碳源［10］；生长环境如温度、pH 值、培养时间等不同都会直接影响乳酸菌胞外多糖的产量［11］，温度过高，导致发生
菌体自溶现象，降低菌体浓度，从而降低EPS 产量，温度过低，乳酸菌生长缓慢，影响EPS 的合成。

研究表明，菌体达到一定浓度时才会进行胞外多糖的合成［12］；在不同环境条件和营养条件下，菌株产生的胞外多糖的化学结构和生理
功能也不同［13］。

可见，影响乳酸菌胞外多糖产量的因素很多，需要深入研究，下一步将确定菌株产胞外多糖的最佳工艺条件。

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