第十章---离心技术2009

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受到的向外的力。离心力(Fc)的大小等于离心 加速度ω2r与颗粒质量m的乘积,即:
F=mω2r
2、相对离心力(relative centrifugal force,RCF):
由于各种离心机转子的半径或者离心管至旋转轴中心的距 离不同,离心力而受变化,RCF就是实际离心场转化为重 力加速度的倍数。
RHale Waihona Puke F 4 2N2rm沉淀(核糖核蛋白体)
上清液(可 溶性组分)
用于分离大小、形状显著不同的组分,根据颗粒沉降速度 不同得以分离。
特点:
• 优点:操作简易,离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀 分开,并可使用容量较大的角式转子。
• 缺点是:须多次离心,沉淀中有夹带,分离效果差,不 能一次得到纯颗粒,沉淀于管底的颗粒受挤压,容易变性失 活。
18
四、沉降系数
在单位离心力场中,颗粒的沉降速度谓 之“沉降系数”。
S d 2 o
2
18
五、沉降时间 六、转子常数 七、分子量计算
M SRT
D1
0

八、离心机
(一)离心机的分类
1.按转速高低及是否有冷冻来分 (1)普通离心机,小于6000rpm (2)高速离心机,8000-25000rpm (3)超速离心机,25000-80000rpm 2.按结构分类 (1)台式离心机 (2)立式离心机 (3)沉降式离心机 (4)转头式离心机 (5)电动式离心机
水平转子
离心管装在转头的吊 桶里,离心时离心管与旋 转轴垂直。其最大速度Vmax = 65,000rpm,最大离心力 400000g。
区带转子(又称Anderson):
• 区带转头的构造是由旋转钵、带有四个翼的转头心和密封 装置等部件组成。
• 离心时不用离心管。 Vmax = 60,000rpm。 • 没有“壁效应”。 • 适用于密度梯度离心。
用途:
差速离心的分辨率不高,沉降系数在同一 个数量级内的各种粒子不容易分开,常用于颗 粒或密度差别较大的组分的分离,或其他分离 手段之前的粗制品提取。

已破碎的细胞

500g,10’



沉淀(细胞核)
上清液
细 胞
10 000g,10’



上清液
沉淀(细胞膜碎片、
100 000g,3h
线粒体、溶酶体)
第一节 基本原理和设备
一、沉降和离心
沉降作用:悬浮液静置时,在重力作用下,密度 大于周围溶液的固体颗粒逐渐下沉。
特点:缓慢、沉降不完全。 影响沉降的因素:颗粒大小、颗粒密度、溶液黏度
离心技术:利用旋转产生的离心力代替重力,加速 固体沉降速度的一种分离方式 。
特点:快速、沉降较完全、分辨率高。
第十章 离心技术
本章要求:
基本概念:离心力,相对离心力,沉降速度,沉降系数 相对离心力的计算 螺旋卸料离心机的特点 影响沉降速度的因素 制备型离心机常用的转子 差分离心法 速度区带离心法及其特点,等密度离心法及其特点 密度梯度离心常用的介质有哪几类 密度梯度的制备方法 梯度的回收方法 了解分析型离心技术
(二) 离心管
• 主要用塑料和不锈钢制成。 • 塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE),聚碳酸酯(PC), 聚丙烯(PP)等,其中PP管性能较好。 • 塑料离心管的优点是透明(或半透明),硬度小,可用穿 刺法取出梯度。缺点是易变形,抗有机溶剂腐蚀性差,使用 寿命短。 • 不锈钢管强度大,不变形,能抗热,抗冻,抗化学腐蚀。 但用时也应避免接触强腐蚀性化学药品,如强酸、强碱等。
3600mg
4 2N2r 1.11810-5 N2rx g
3600 980
式中r为离心转子的半径距离,以cm为单位;g为地 球重力加速度(980cm/sec2);N为转子每分钟的转数 (rpm)。
三、沉降速度
即在离心力作用下,物质粒子于单位时间内 沿离心力方向移动的距离。
d 2 0 2 x
离心技术的形式:
1、离心沉降:按密度差异,固--液分离。 2、离心过滤:辅以滤材,固--液分离。 3、离心分离:借助梯度介质和离心力分开密度
和沉降系数不同的多种颗粒组分。 4、离心分析:借助光学分析系统,测定组分颗
粒的密度、分子量、沉降系数等 物理参数。
二、离心力
1、离心力(centrifugal force,Fc): 在一定角度速度下作圆周运动的任何物体都
6 、冷冻高速、超速离心机
指相对离心力在100,000g以上的离心设备, 通 常 转 速 > 60,000rpm , 目 前 最 高 转 速 已 达 160,000rpm,相对离心力达1,000,000g以上。
又分制备性、分析性和制备兼分析性离心机。 多用于蛋白质、酶、核酸、多糖、细胞器的分离 纯化及其沉降系数、分子量、扩散系数的分析和 构像的观察。
离心分离
(一)差分离心
概念:
差分离心法亦称“差速离心法”,是依据不 同大小和密度的颗粒在离心力场中沉降速度的不 同进行离心分离的一项技术。
过程是将样品溶液在一定离心力场中离心一 定时间使颗粒大组分沉降于管底,上层液再用加 大的离心力场离心一定时间,又可获得中等大小 的组分。如此依次提高离心力,逐级分离出所需 组分,故称其为差分离心法。
是一种离心分离机。 有一管式转筒,料液自转筒下部压入。 在离心力作用下,轻、重液分层;上部两侧有重
液和轻液排出口。 转速>10000r/min,分离因素15000-60000g。 用于分离两种轻重不同而又互不相溶的液体最有
效。
管式高速离心机
3、 蝶片式离心机
• 分离原理相似于管式机。 • 转子中有许多碟片,沉降 距离短,分离效率高,甚 至可用作液-液-固分离,容 量大。 • 在医药、食品及化工中应 用较广。
(三)等密度离心法
概念:
离心力作用下,不同密度的多组 分颗粒在梯度介质中“向上”或“向 下”移动,当移动至其密度与介质密 度相等的位置便不再移动,形成静止 区带,即达到离心平衡,各组分按密 度不同处于区带的不同位置。该离心 方法称等密度离心法。
特点:
(1)加样位置不拘。 (2)离心平衡后,区带的位置、形状、不受离心时间影响。 (3)梯度的密度范围应包括样品中所有组分颗粒之密度。 (4)分离依据是颗粒组分间密度的差异,与颗粒大小,形状
五、密度梯度技术
(一)密度梯度的作用: 1、增加分离层次,提高分辨率。 2、防止温差及振动造成的影响。
3、离心后管内分为三层,上层为血浆,下层主要为红细胞和粒 细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单 核细胞为主的白色云雾层狭窄带,单个核细胞包括淋巴细胞 和单核细胞。
4、用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一短中管 中,加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640,1500rpm×10 分钟,洗涤细胞两次。
垂直管转子
• 离心管中心线与转轴平行,是一种特殊类型的定角转子。 • 离心时,对流不显著,沉降时间短。Vmax =100,000rpm
以上,g = 700,000。 • 适用于差速、密度梯度及等密度离心。
垂直管转子
连续离心转子
• 离心杯与旋转轴成固定角度,同时设有进液口和出样口, 以便在连续离心时进液和出液。 • Vmax=32,000rpm。 • 适用于培养液中收集菌体 及细胞。
• 取小公牛肾上腺,D-Hank’s 溶液冲洗后,肾上腺充分消化 后剥除皮质,将髓质剪碎成1 mm左右的小块,滴加少量 DHank’s液以保持髓质的营养,将滤过的细胞悬液在100 × g 下离心8min。
• 将细胞悬液离心后与密度为1. 090 g / ml 的Percoll 溶液 混 合 , 加 入 离 心 管 底 部 , 在 其 上 分 别 缓 慢 加 入 密 度 为 1. 064 g / ml、1.034 g / ml、1.019 g / ml 的Percoll 溶液, 室温下离心,200 × g,20min。收集介于密度为1.064 g / ml 与1.034 g / ml 的两层Percoll溶液界面之间的细胞, 加入D-Hank’s 液混悬后,在100 × g 下离心洗涤2 次, 每次8 min。得细胞。
塑料离心管都有管盖,离心前管盖必须盖严,倒置不漏 液。
管盖有三种作用:
①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时,这 点尤其重要。
②防止样品挥发。 ③支持离心管,防止离心管变形。
二、离心方式:
1、差分离心法(差速离心法)--离心沉降 2、速度区带离心法 (速率区带离心法) 3、等密度区带离心法
无关。 (5)离心力大小,组分颗粒的大小和形状,介质密度梯度的
斜率和形状,粘度影响离心时间和分辨率。
Percoll 非连续等密度梯度离心法纯化牛肾上腺嗜铬
细胞
• 疼痛和帕金森病,体外无增殖能力,只能依赖于肾上腺髓质 的分离来获取。
• 实验动物年龄在1 岁左右的健康小公牛,体重约200~ 400 kg。
• 角度越大,沉降越结实,分离 效果越好,相反,角度越小,颗 粒沉降距离短,沉降速度快,但 分离效果差。 • 颗粒在角转子中沉降时,先沿 离心力方向撞向离心管,然后再 沿管壁滑向管底,因此管的一侧 会出现颗粒沉积,称为“壁效 应”。 最适合差速离心,强度大、方便, 但加速或减速时,对样品有搅动。
角度转子
第二节 制备型超离心技术
一、离心设备 (一)转子 1、 角度转子 2 、水平转子 3 、区带转子 4 、垂直管转子 5 、连续离心转子 6 、细胞洗脱转子
角度转子
指离心管与旋转轴之间成一定角度。通常在14-40 之 间 , 其 最 大 速 度 可 达 10,000rpm , 最 大 离 心 力 可 达 800,000g。
4、 离心过滤机
借离心力进行过滤分离的设备。 由转鼓外壳(承液)、底坐支
架(三足)等部件构成。 转鼓多层覆以滤布,结构简单,
操作方便,性能可靠,可分离 比重相似的固-液两相。 但不能连续操作,卸料麻烦。
5、 卧式螺旋卸料沉降离心机
卧式螺旋卸料离心机主要 由转鼓、螺旋和差速器组 成,转鼓由主电机拖动。 螺旋由付电机通过差速器 来拖动。高速旋转的转鼓 内装有输料螺旋,其旋转方 向与转鼓相同,但两者之间 由差速器产生一定的速度 差.悬浮液从进料管进入机 内,在离心力的作用下, 悬 浮液固相被沉降在转鼓内 壁,由输料螺旋推送到转鼓 小端,从沉渣口排出,澄清后 液相从转鼓大端溢流口流 出。
特点:
(1)样品加于梯度介质的顶部、离心时间须严格控制。 (2)介质的密度亦须严格掌握:梯度最大值≤组分最小密度。 (3)样品的密度<梯度密度最小值。 (4)分离依据是各组分之沉降系数差。 (5)分辨率受组分沉降系数,离心时间,颗粒扩散系数,介
质粘度及梯度范围和形状的影响。
用途:
本法适于分离颗粒大小不同而密度相近或相同的组分, 如DNA与RNA混合物、核蛋白体亚单位及线粒体、溶酶体及 过氧化物酶体等。
速度区带离心法用于分离大小差别不显著的组分
Ficoll密度梯度离心法分离外周血单核细胞
(一) 原理:
红细胞、粒细胞比重大,离心后沉于管底;淋巴细胞和单 核细胞离心后漂浮于分层液的液面上,吸取分层液液面的细 胞,就可从外周血中分离到单核细胞。
(二) 方法:
1、在短管中加入适量细胞分离液。
2、取肝素抗凝静脉血,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上, 注意保持清楚的界面。离心2000rpm×20分钟。
(二)速度区带离心法
概念:
又称速率区带离心法或分级区带离心法。离心 操作时将样品液置于连续或不连续,线性或非线 性 密 度 梯 度 液 上 ( 如 蔗 糖 、 甘 油 、 KBr 、 CsCl 等),控制离心时间,使具有不同沉降速度的粒 子处于不同的密度梯度层内分成一系列区带,从 而达到彼此分离的目的。这种离心方法称速度区 带离心法。
3.按工作性质分类 (1)制备型离心机 (2)实验室用离心机, 4.按操作方式分类
(1)连续离心机 。 (2)人工卸料(出渣)离心机; (3)自动卸料离心机(如螺旋式离心机)
(二)常用离心机
1、普通离心机 2、管式高速离心机 原理: 应用:液固,液液,发酵工程酶工程中分离菌体
台式离心机
管式高速离心机
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