优良窖泥功能菌的筛选及其生物学特性的初步研究

培养窖泥功能菌主要是培养适合于窖泥环境的产己 酸和丁酸物质的芽孢菌 。 浓香型白酒的主要香气成分是 己酸乙酯 ， 这种香气成分主要与老窖泥中存在的产香细 菌有关 ，尤其是梭状芽孢杆菌属的己酸菌作用很大 [1]。 所 以 ，己酸菌广泛应用于液态法白酒和浓香型白酒生产上 ， 除了用于培养窖泥以缩短窖泥老熟时间外 ， 还可以通过 其他途径增加成品酒中己酸乙酯的含量 。 但采用优质老 窖泥作菌源培养窖泥功能菌液 ， 对退化窖泥的养护具有 一定的效果 ， 但要彻底改善退化窖泥的质量有一定的难 度[2]。 因此 ，筛选产己酸高的细菌及其最佳产酸条件的研 究一直是白酒行业专家学者十分重视的课题 。
乙醇和乙酸钠是己酸菌得以生长产酸的重要营养成 分 ， 不同的乙醇和乙酸钠浓度对 LJ-1 菌株己酸产量的影 响见表 4。 从表 4 结果可看出 ，1 % ～4 % 的乙醇浓度对 LJ-1 的生长影响不大 ， 而乙酸钠对 LJ-1 的产酸量影响 较大 ，2 %的乙醇和 2 %的乙酸钠是最适合的碳源组成 。 2.4.2 温度及初始 pH 对 LJ-1 菌株产酸的影响 温度及 pH 试验用大试管进行液体深层培养 。 温度 范围 20～45 ℃， 结果见图 1。 LJ-1 在 20～45 ℃范围内都 可产酸 ， 最适的产酸温度是 35 ℃。
10 mL， 碳酸钙 5g， 乙醇 20 mL， 自来水 1000 mL， 琼脂 20 g，pH7.0～7.2。 1.1.3 发酵培养基 乙 酸 钠 0.5 % ， 酵 母 膏 0.1 % ， 碳 酸 钙 0.5 % ， 乙 醇 2 %，1∶3 的糟醅浸提液 50 %，pH7.0～7.2。 1.2 方法 1.2.1 窖泥微生物的分离 取 5 g 老窖泥 85 ℃ 加热处理 10 min ， 冷却后加入富 集培养基培养 5 d 后 ， 对富集菌液再次进行热处理以富 集产己酸的芽孢杆菌 ，35 ℃ 培养 7 d， 选取产气泡好的富
Screening of Quality Functional Bacteria in Pit Mud and Study of Its Biological Properties
YAO Wan-chuan ，TANG Yu-ming，REN Dao-qun and LIAO Jian-min
(Luzhou Wine-making Research Institute, Luzhou, Sichuan 646000, China) Abstract: A caproic acid bacteria strain of high-yield of acid was isolated from century-old pit mud in Luzhou Laojiao Distillery. Such strain was quite different from Clostridium Kluyverii in biological properties through preliminary identification. The research on its acid-producing conditions was summarized as follows: the optimum growth temperature was at 35 ℃ , the optimum pH value was about 7.0 ～7.5, ethanol and sodium acetate were the main mediums for its growth and acid-producing, the highest acid-producing level was 500 mg/mL, and living bacteria number was above 0.5 billion/mL. Key words: pit mud; caproic acid bacteria; fermentation; caproic acid
取己酸产量高的菌株 。 菌株的纯化要同发酵产物己酸的 测定同时进行 ， 最后 ， 菌株经平皿 、 显微镜和革兰氏染色 检查符合纯度标准后 ， 再作鉴定 、 保存 。 1.2.4 检测方法 己酸菌的细胞数测定 ： 采用血球计数板法 ； 己酸菌的 形态特征和生理生化特性的测定 ： 按文献 [4] 进行 。
2.3 LJ -1 菌株发酵过程菌液的 变化情况
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姚万春， 唐玉明， 任道群， 廖建民· 优良窖泥功能菌的筛选及其生物学特性的初步研究

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2 2.1
结果与分析 菌株的筛选
对取自泸州老窖酒厂的几个百年老窖泥样品进行了 富集分离 ， 经厌氧培养后 ， 挑取有代表性的细菌菌落约 100 个 ， 接入发酵培养基中进行初筛 ， 初步筛选出产己酸 较高的菌株 7 株 ， 然后对这 7 株菌株进行反复分离纯化 ， 直到镜检观察菌体形态一致后 ， 经液体扩大培养 ， 用气相 色谱定量检测己酸含量 （ 结果见表 1）， 筛选出己酸产量 最高的菌株 LJ-1， 结果见表 1。




Hale Waihona Puke 图1
温度对LJ-1 菌株产酸的影响
pH 试验的结果见图 2。 LJ-1 菌株的适宜产酸 pH 范 围为 6.5～7.5。 同多数细菌一样 ， 己酸菌不宜在偏酸环境
646000)
要： 从泸州老窖酒厂百年老窖泥中分离到 1 株产酸高的己酸菌株， 经初步鉴定， 该菌与克氏梭菌 （Clostridium
Kluyverii ） 的特性不很相同。经对该菌株产酸条件研究， 其最适生长温度为 35 ℃， 最适 pH 为 7.0～7.5， 乙醇和乙酸 钠是该菌生长和产酸的主要基质， 最高产酸量达 500 mg/mL， 活菌数达 5 亿个 /mL 以上。 关键词： 窖泥； 己酸菌； 发酵； 己酸 中图分类号 ：TS262.3 ；TS261.4 ；Q93-3 文献标识码 ：A 文章编号 ：1001－9286 （2010 ）11－0033－03
酿酒科技
· 2010 年第 11 期 （ 总第 197 期 ） LIQUOR－MAKING SCIENCE ＆ TECHNOLOGY 2010 No．11(Tol．197)
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优良窖泥功能菌的筛选及其生物学特性的初步研究
姚万春， 唐玉明， 任道群， 廖建民
(四川省泸州市酿酒科学研究所 ， 四川 摘
泸州
下生长 ， 中性或偏碱环境是己酸菌产酸最适环境 。 2.4.3 酵母浸提物对 LJ-1 菌株生长及产酸的影响 进行了不同酵母浸提物浓度对 LJ-1 菌株的影响试 验 ，35 ℃ 培养 10 d 后测定 ， 结果见表 5。 表 5 结果表明 ，
2.2
LJ-1 菌株形态和生理生化特性 获得 LJ-1 菌株后 ， 按照细菌鉴定手册 [5]对其基本形
1
材料与方法
1.1 材料 1.1.1 窖泥
窖泥样品取自泸州老窖酒厂百年老窖池 。 1.1.2 培养基 富集培养基 ： 乙 酸 钠 5 g， 酵 母 膏 5 g， 生 物 素 5 μg， 无机盐溶液 10 mL， 乙 醇 30 mL， 碳 酸 钙 5 g，1 ∶3 的 糟 醅 浸提液 50 mL，自来水 950 mL，pH7.0～7.2。 分 离 培 养 基 ： 乙 酸 钠 5 g， 酵 母 膏 2 g， 无 机 盐 溶 液
LJ-1 菌株生长以 0.5 % 的酵母浸提物浓度为好 ， 产酸以 0.1 %酵母浸提物浓度为好 。 2.4.4 接种量对菌株产酸量的影响 将生长旺盛的菌体分别以 2 %～10 % 的接种量接种 培养 5～11 d， 观察接种量对产酸的影响 ， 同时考察接种 量与发酵时间的关系 (见表 6)。 从表 6 结果看 ， 无论接种量大小 ， 在 5～9 d 之间 ， 均 是丁酸降低 ， 己酸增加 ； 接种量小 ， 丁酸在接种后 5 d 时
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图2
pH 对LJ-1 菌株产酸的影响
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液态发酵过程菌液的变化情况见表 3。 从表 3 分析 可知 ，LJ-1 进行液态发酵时 ， 初期发酵液产生乙酸 、 丁 酸 、 己酸 ， 可能有一定的特殊臭味 ， 到 10 d 以后 ， 会有少 量的酯生成 ， 而后产生香味 ， 发酵液逐渐变香 。
2.4 多因素对 LJ-1 菌株己酸产量的影响 2.4.1 乙醇和乙酸钠浓度对己酸产量的影响
态及生理生化特性进行了测定 ， 结果如下 。 2.2.1 形态特征 细胞为 直 杆 状 ， 菌 体 大 小 为 3 ～5 ×0.5 ～ 0.8 μm，单生 、成对或呈 “Y” 字形 ； 芽孢圆形 ， 端 生或偏端生 ， 芽孢囊膨大 成 蹈 锤 状 ， 以 周 生 鞭 毛运动 ， 革兰氏染色阴性 。 !" #$!" 2.2.2 培养特征 % & ’( )*+, - ./01 该菌株在分离培养平板上划线厌氧培养 23425 678 9 :;< ;<=>:? ;< 36 h 开 始 长 菌 落 ，72 h 菌 落 直 径 达 2 ～3 mm， ;< 4@A2 BCD:8 :4E: 圆形，边缘不规则 ，表面平滑或 细 粒 状 ，乳 脂 色 ， 不透明 。 最适生长温度 34 ～ 35 ℃，pH6.5～7.5 均生长良好 。 2.2.3 生理生化特性 !"# $%& ’ #()*+’ LJ -1 菌 株 的 生 理 生 化 特 性 72 ,-./#012 $34%& ’ )+5#67* 见表 2。 引用 “ 伯杰氏细菌鉴定手 96 #8 -#012 $9:%& ’ ;<5=#7>* #012’A BC DE F67*G6HI 册 ”， 从形态和生理生化特征看 ， ?@ ? #012’A BC JKL HI6MNF 该菌与克氏梭菌的特性不很相 ?O P?Q 2R, R, HI’F 同。
集液经适当稀释 ， 在分离培养基上 ， 采用夹层法厌氧培 养。 1.2.2 己酸菌的初筛方法 挑选平板上的单个菌落移入发酵培养基试管中培养 10 d， 根据比色定量测定己酸的方法 [3]初步测定发酵液中 的己酸含量 ，并结合发酵液的感官 、 产气情况和浑浊度等 指标 ，确定复筛菌株 。 1.2.3 己酸菌的复筛 对被确定为复筛的菌株再次进行单菌落分离 ， 并对 各单菌落进行发酵试验 (35 ℃ ，10 d) ， 然后选取有酯香 味 、 产气较多的浑浊发酵液进行己酸的气相色谱测定 ， 选
收稿日期 ：2010－07－26
姚万春 (1964-) ， 女 ， 四川泸县人 ， 副研究员 ， 从事发酵微生物研究 20 余年 ， 获省级重大科技成果 5 项 ， 发表论文 50 余篇 。 作者简介：
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酿酒科技
· 2010 年第 11 期 （ 总第 197 期 ） LIQUOR－MAKING SCIENCE ＆ TECHNOLOGY 2010 No．11(Tol．197)
表5结果表明表2lj1菌株的生理生化特性结果测定项目不严格厌氧硝酸盐还原试验硫化氢产生试验吲哚产生试验明胶水解试验一淀粉水解试验过氧化氢酶试验vp及甲基红试验产氨试验柠檬酸盐利用试验乙醇和乙酸钠生成已酸丁酸糖发酵试验发酵试验和少量乙酸项目结果一一一一一需氧情况发酵葡萄糖不发酵纤维二糖果糖和核糖表3发酵过程中菌液的变化情况产气无振荡有气泡冒出较清时间h24487296120144168192臭味减弱216240微弱的酯香味264288较浓的酯香味288以后有白酒香味感官浑浊显微镜观察酒精气味无味微弱的特殊有机酸臭味气泡偶尔冒出有明显的有机酸臭味有机酸臭味较浓有机酸臭较浓清菌体稀少分散有些链杆状菌体较分散菌体链状有少数单杆菌菌体成对也有单个杆菌多数单杆菌少数芽孢浑浊度加大芽孢数目增多浑浊芽孢较多浑浊芽孢较多浑浊芽孢较多浑浊芽孢脱落较清较清开始浑浊气泡连续冒出产气旺盛产气旺盛产气减弱产气极少产气基本停止产气停止姚万春唐玉明任道群廖建民优良窖泥功能茵的筛选及其生物学特性的初步研究表4乙醇和乙酸钠浓度对己酸产量的影响表6接种量对产酸的影响3600昌500400鎏300衄20010oobb