山羊痘病毒P32基因的克隆、测序及在原核细胞表达

山羊痘病毒P32基因的克隆、测序及在原核细胞表达
程振涛;岳筠;徐春志;李永明;许乐仁;文明;周碧君
【摘要】为比较山羊痘病毒贵州分离株P32基因与国内外分离株的关系,并获得
P32蛋白,应用PCR方法从贵州山羊痘病毒分离株的核酸样本中扩增出P32基因片段,将PCR产物克隆至pMDl8-T载体,对重组质粒进行了基因序列测定.将测定的
P32基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与GenBank中相应序列作比较,同源性分别达到99.4%和98.4%,表明山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性.将P32基因克隆至原核表达载体pET-28a,成功构建重组表达质粒pET-28a-P32/LD,转化至大肠杆菌BL2l(DE3)进行诱导表达.SDS-PAGE检测显示,重组细菌在35.5 kDa处表达一条特异性的蛋白带,而阴性对照未见这条蛋白带;Western-Blotting检测证实,这条蛋白带能与山羊痘高免血清反应而显示其免疫学活性.
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2008(000)004
【总页数】4页(P57-60)
【关键词】山羊痘病毒;P32基因;基因克隆;序列分析;原核表达
【作者】程振涛;岳筠;徐春志;李永明;许乐仁;文明;周碧君
【作者单位】贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物
科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025;贵州大学动物疫病研究所/贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025【正文语种】中文
【中图分类】S852.654
山羊痘是由山羊痘病毒(goat poxvirus，GPV）引起的一种高度接触性传染病，临床上以发热、皮肤和黏膜上出现痘疹为特征。

近年来，在我国的陕西、甘肃、四川、贵州、云南、广西等省区发生流行，给养羊业造成了极大损失，特别是给西部地区蓬勃兴起的山羊养殖业带来了严重威胁。

山羊痘病毒属痘病毒科羊痘病毒属(Capripoxvirus），羊痘病毒属包括绵羊痘病毒、山羊痘病毒和牛疙瘩皮肤病病毒，3种病毒之间关系紧密，同源性极高［1］。

羊
痘病毒属成员为线形、双链DNA病毒，基因组长度大约为150 kb。

关于羊痘病
毒基因组的研究是在与痘苗病毒进行比较的过程中逐渐展开的。

Chand等［2］发现与痘苗病毒H3L同源基因所编码的蛋白(即P32蛋白）是特异性很强的结构蛋白，羊痘病毒属成员均能表达。

进一步的研究［3］证实P32蛋白是羊痘病毒表面的囊膜蛋白，含有主要的抗原决定簇。

Carn等［4］和Heine等［5］分别利用大肠杆菌表达了谷胱甘肽转移酶和多聚组氨酸融合的重组P32蛋白，并以重组P32蛋白作为抗原建立间接ELISA检测方法，研究了P32蛋白的免疫学活性。

此后，P32
蛋白抗原的特异性使之成为近年来国内外从事羊痘病毒研究的热点。

本试验从山羊痘病毒贵州分离株的核酸样本中扩增出P32基因，对P32基因进行克隆和测序，分析了不同来源山羊痘病毒株P32基因核苷酸和氨基酸序列的同源性。

同时采用原核表达系统构建了表达融合蛋白的重组载体，对P32蛋白的体外
表达进行了初步探索。

1.1 试验毒株
山羊痘贵州分离毒LD株和QL株由本实验室保存，山羊痘标准弱毒B株引自中国兽药监察所，山羊痘疫苗弱毒Y株购自新疆天康畜牧生物技术有限公司。

1.2 质粒与菌种
pMD18－T载体购自大连宝生物工程有限公司，pET－28a原核表达载体、大肠
杆菌DH5α和BL21(DE3）菌种由本实验室保存。

1.3 主要试剂
PCR试剂购自上海生物工程技术有限公司，Gel Extraction kit购自OMEGA公司，限制性内切酶与T4 DNA连接酶购自MBI公司，山羊痘高免血清购自中国兽药监察所，HRP标记兔抗山羊IgG购自北京普生瑞达生物技术发展中心。

1.4引物
根据GenBank公布的山羊痘病毒全基因序列(NC_004003）和已发表的参考文献［6］，应用Primer Premier 5.0设计了扩增P32基因的一对引物(P1/ P2），
P1:5'－CACGGATCCGCAGATATCCCATTATAT－3'，P2:5'－CCCAAGCTTAACTATATAGGTAAATAAC－3'。

1.5 病毒DNA提取与P32基因扩增
将山羊痘病毒LD株、QL株、B株和Y株分别接种BHK－21单层细胞，待80%
以上细胞病变后收获感染细胞培养物，采用传统的SDS－Proteinase K法提取病
毒DNA。

PCR扩增为50 μl的反应体系:10×Taq(含MgCl2）5 μl，dNTP(10 mmol/L）1 μl，Taq DNA聚合酶(2.5 U/μl）1 μl，P1/P2引物(10 pmol/μl）各2.5 μl，病毒DNA模板1 μl，灭菌双蒸水37 μl。

按下列程序进行PCR扩增:95℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，34个循环；最后72℃延伸10 min。

取PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 P32基因克隆与测序
按照Gel Extraction kit的说明书操作，从琼脂糖凝胶中切取、回收目的DNA片
段，与pMD18－T载体相连接，转化感受态细胞DH5α。

在涂有氨苄青霉素、X －gal、IPTG的LB琼脂平板上根据蓝白斑筛选阳性重组质粒，经酶切鉴定后将重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序。

应用DNAStar、BLAST (NCBI）软件与GenBank登录的相应序列进行比较，分析不同来源山羊痘病毒株P32基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列的同源性。

1.7 P32基因原核表达载体构建
对测序的重组质粒DNA进行BamHⅠ+HindⅢ双酶切，回收目的基因片段，采用T4 DNA连接酶与同样处理的pET－28a相连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3）感受态细胞，通过特异性引物和限制性内切酶鉴定P32基因阳性重组细菌。

1.8 P32基因原核表达产物检测
将1.7鉴定的阳性重组细菌接种到LB培养液(含50 μg/ml卡那霉素），37℃振荡培养至菌液OD600值为0.5～1.0时，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，37℃诱导表达4 h。

收集菌液2 ml经4℃、12 000 r/min离心5 min，弃上清液，采用0.01 mol/L、pH值7.4的PBS 100 μl悬浮细菌沉淀物，加入等体积的2×样品缓冲液，水浴煮沸5 min，通过SDS－PAGE检测表达产物。

将凝胶中的蛋白带转印至聚偏氟乙烯(PVDF）膜上，3%BSA室温封闭过夜。

然后以山羊痘高免血清(1∶400）为一抗，HRP标记兔抗山羊IgG(1∶300）为二抗进行免疫印迹反应。

最后在DAB+H2O2溶液中显色鉴定。

2.1 PCR扩增及初步鉴定
采用P1/P2引物进行PCR扩增，从4株山羊痘病毒感染细胞培养物的核酸样本中扩增出1条约1 000 bp大小的DNA带，而正常细胞显现阴性反应(图1）。

取贵州分离毒株PCR产物进行HinfⅠ酶切反应，电泳分离得到约700 bp和300 bp 的两条带(图2），与预期大小相符合。

2.2 PCR产物克隆与重组质粒鉴定
从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，与pMD18－T载体相连接，转化感受态细胞
DH5α。

挑选白色菌落提取质粒DNA样本，采用BamHⅠ+HindⅢ进行双酶切鉴定，得到约2 660 bp和1 000 bp两条带，与预期结果一致。

2.3 P32基因核苷酸序列测定及同源性分析
将鉴定的重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序，4株山羊痘病毒的P32基因
均为969 bp(Gen-Bank登录号分别为EF514889、EF514890、EF514891和
EF514892）。

将上述P32基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列与国内外不同来源山羊痘病毒株的相应序列进行比较，结果见表1。

贵州分离毒株LD、QL的P32基因序列与山羊痘疫苗毒株核苷酸序列的同源性分
别达到99.8%和99.9%；推导的氨基酸序列同源性达到99.4%和99.7%。

与国内外不同来源的山羊痘病毒分离株相比较，P32基因核苷酸和氨基酸序列的同源性
分别达到99.4%和98.4%以上。

同源性分析结果表明，山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性。

2.4 P32基因原核表达载体构建
重组细菌通过含卡那霉素(50 μl/ml）的抗性平板筛选，提取重组细菌质粒DNA
样本，采用BamHⅠ和BamHⅠ+HindⅢ分别进行单、双酶切鉴定，单酶切结果
显现1条6 300 bp的DNA带；双酶切结果显现2条DNA带，1条为5 300 bp，即载体DNA带，另1条为1 000 bp，即目的DNA带(图3）。

对重组质粒双酶
切获得的载体带大小与空载体处理的结果相符合。

以P32基因特异性引物P1/P2
对重组质粒进行PCR扩增，获得与预期大小相一致的DNA片段。

由此证实P32
基因已插入原核表达载体中，成功构建了P32基因原核表达载体，命名为pET－28a－P32/LD。

2.5 P32基因原核表达产物检测
SDS－PAGE检测结果显示，重组细菌在IPTG诱导下表达1条35.5 kDa大小的
特异性蛋白带，而对照细菌未见这条蛋白带(图4）。

免疫印迹反应检测结果显示，表达的这条特异性蛋白带能与山羊痘高免血清反应而显色，证实其具有免疫学活性(图5）。

山羊痘病毒、绵羊痘病毒和牛疙瘩皮肤病病毒同属于羊痘病毒属的成员，3种病毒主要是按照易感宿主划分，它们的病毒形态、理化特性和血清学反应没有区别。

Hosamani等［7］从山羊痘流行毒株和绵羊痘疫苗毒株中分离鉴定了P32基因，发现山羊痘病毒的P32基因只有1个HinfⅠ酶切位点，而绵羊痘病毒的P32基因含有2个Hin fⅠ酶切位点。

本试验对2株山羊痘贵州分离毒株的PCR产物进行HinfⅠ酶切反应，电泳分离得到约700 bp和300 bp的2条带，表明被测毒株的P32基因只有1个HinfⅠ酶切位点，DNA片段大小与预期长度相符合。

试验结果证实了PCR产物的特异性，显示了山羊痘病毒在基因水平上与绵羊痘病毒的差异。

2002年，Tulman等［8］对山羊痘病毒的全基因组序列测定工作完成，P32基
因定位于病毒基因组的64～65 kb处，全长969个核苷酸，编码323个氨基酸；羊痘病毒的P32基因具有高度保守性，世界各地不同分离株的P32基因核苷酸序列同源性达到97%。

本试验对山羊痘贵州分离病毒LD株和QL株的P32基因进
行测序，其核苷酸序列与国内黑龙江、广西分离株的同源性达到99.7%以上，与
印度、哈萨克斯坦分离株的同源性达到99.5%～99.6%，显示了山羊痘病毒P32
基因的高度保守性。

目前，国际上对羊痘病毒P32基因的体外表达主要采用原核表达系统和真核表达
系统。

国内学者康文玉等［6］采用原核表达系统(pBAD/Thio－TOPO）在体外表达了山羊痘病毒P32蛋白抗原；郭建刚等［9］采用真核表达系统使P32基因在
重组杆状病毒中获得表达。

本项试验选用原核表达载体pET－28a对山羊痘病毒
P32基因进行了融合表达，表达产物能够被山羊痘高免血清识别，从而证实其具
有免疫学活性。

由于表达产物是一种融合蛋白，即多聚组氨酸融合的重组P32蛋
白，曾采用HRP标记的抗多聚组氨酸抗体进行免疫印迹反应，结果在35.5 kDa
处显现1条特异性的表达带。

与山羊痘高免血清的印迹反应相比较，抗多聚组氨
酸的酶标抗体只能显示融合蛋白的表达，不能证实P32蛋白的免疫学活性。

本试
验在进行原核表达时，尽管目的基因的表达量不高，但仍然可以检测到，且表达产物具有良好的免疫学活性，这为进一步研究山羊痘病毒P32基因的结构与功能奠
定了基础。

［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京:科学出版社，1997:960－963. ［2］Chand P，Kitching R P，Black D N.Western blot analysis of virusspecific antibody responses to capripoxvirus and contagious pustular dermatitis infections in sheep［J］.Epidemiol Infect，1994，113:377－385. ［3］Heine H G，Lin C L，Chung C S.Vaccine virus envelope H3L protein binds to cell surface heparan sulfate and is important for intracellular mature virion morphogenesis and virus infection in vitro［J］.Virol，2000，74(4）:3353－3365.
［4］Carn V M，Kitching R P，Hammond J M，et e of a recombinant antigen in an indirect ELISA for detecting bovine antibody to capripoxvirus ［J］.J Virol Methods，1994，49:285－294.
［5］Heine H G，Stevens M P，Foord A J.A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32，the homolog of the vaccine virus H3L gene［J］.J Immun Methods，1999，227:187－196. ［6］康文玉，徐自忠，花群义，等.羊痘病毒P32蛋白编码基因的克隆及表达［J］.中国兽医科学，2006，36(6）:454－459.
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［9］郭建刚，郑敏，刘棋，等.山羊痘病毒P32基因在杆状病毒中的表达［J］.中国兽医科技，2005，35(12）:950－953.
【相关文献】
［1］殷震，刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京:科学出版社，1997:960－963.
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中图分类号：S852.654。