睾酮对血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合成的影响

睾酮对血管紧张素Ⅱ诱导的乳鼠心肌成纤维细胞增殖和胶原合
成的影响
孙丽娜;王颖;燕树勋;张彦周;魏子涵;秦鹏;孙素珂
【摘要】Aim : To explore the effect and the mechanism of testosterone on proliferation and collagen synthesis of neonatal rat cardiac fibroblast ( CF) induced by angiotensinⅡ( AngⅡ) .Methods:CFs derived from the neonatal rat were cultured with serum-free DMEM culture ( control group ) , 10 -6 mol/L Ang Ⅱ ( Ang Ⅱ group ) , 30 nmol/L testosterone (testosterone group), or 30 nmol/L testosterone and 10 -6 mol/L Ang
Ⅱ(testosterone+Ang Ⅱ group) for 24 h, respec-tively.Flow cytometry technique was used to detect the cell cycle distribution .VG staining method was used to detect the contents of collagen , and immunocytochemistry method was used to detect phosphorylated ERK 1/2 ( p-ERK1/2 ) expres-sion.Results:S phase cells proportion , collagen content and p-ERK1/2 expression level of AngⅡgroup were significantly higher than those of the control group and testosterone group , and these indexes of testosterone +AngⅡgroup were lower than those of
AngⅡgroup(S phase cells proportion:FAngⅡ=30.403,Ftestosterone
=5.812,Finteraction =18.073,P<0.05;collagen con-
tent:FAngⅡ=10.365,Ftestosterone =4.533,Finteraction =42.049,P<0.05;p-ERK1/2 expression level:FAngⅡ=174.762,Ftestosterone
=184.828,Finteraction =152.240,P<0.05).Conclusion: Testosterone can inhibit CF proliferation and collagen synthesis in-duced by AngⅡ, and the
mechanism may be related to the inhibition of ERK 1/2 activation .%目的：观察睾酮对血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）诱导的乳鼠心肌成纤维细胞（ CF）增殖和胶原合成的影响。

方法：分离、培养CF，分别用无血清DMEM培养液（对照组）、含10-6 mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养液（AngⅡ组）、含30 nmol/L睾
酮的无血清DMEM培养液（睾酮组）、含30 nmol/L睾酮和10-6 mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养液（睾酮＋AngⅡ组）培养24 h，应用流式细胞技术检测
细胞周期分布，VG染色法检测胶原含量，免疫细胞化学染色法检测磷酸化
ERK1/2（p-ERK1/2）的表达。

结果：AngⅡ组S期细胞比例、胶原含量和p-ERK1/2表达水平较对照组和睾酮组明显增加，睾酮＋AngⅡ组S期细胞比例、胶原含量和p-ERK1/2表达水平较AngⅡ组明显降低（ S期细胞比例：FAngⅡ＝30．403，F睾酮＝5．812，F交互＝18．073，P＜0．05；胶原含量：FAngⅡ＝10．365，F睾酮＝4．533，F 交互＝42．049，P＜0．05；p-ERK1/2表达水平：FAngⅡ＝174．762，F睾酮＝184．828，F交互＝152．240，P＜00．5）。

结论：睾酮可能通过抑制ERK1/2的活化，抑制AngⅡ诱导的CF的增殖和胶原合成。

【期刊名称】《郑州大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】4页(P461-464)
【关键词】睾酮;血管紧张素Ⅱ;心肌成纤维细胞;增殖;胶原;ERK1/2;乳鼠
【作者】孙丽娜;王颖;燕树勋;张彦周;魏子涵;秦鹏;孙素珂
【作者单位】郑州大学第一附属医院老年医学科郑州450052;郑州大学第一附属
医院老年医学科郑州450052;河南中医学院第一附属医院内分泌科郑州450008;
郑州大学第一附属医院心内科郑州450052;郑州大学第一附属医院老年医学科郑
州450052;郑州大学第一附属医院老年医学科郑州450052;河南省高等学校临床
医学重点学科开放实验室郑州450052
【正文语种】中文
【中图分类】R542.2
心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CF)是心肌组织中含量最多的细胞，占
60% ～70%，在维持心脏正常结构和功能方面起重要作用[1-2]。

在各种致病因素的作用下，心肌间质CF增多，将导致胶原合成增加并过度沉积、基质蛋白合成增多，最终导致心肌纤维化[3]。

心肌纤维化是高血压、冠心病、心力衰竭等心血管
疾病心肌重构发生发展的重要机制之一[3]。

导致心肌纤维化的因素很多，已知肾
素-血管紧张素-醛固酮系统(RAS)的过度激活是导致心肌纤维化的重要因素之一。

血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)是RAS中重要的生物学效应分子[4]，可刺激胶原合成，诱导CF增殖，在心肌纤维化、高血压、动脉粥样硬化发生发展过程中发挥重要作用[5]。

近年来研究[6-7]显示睾酮对心血管系统有保护作用，但其机制尚不清楚。

作者用AngⅡ诱导乳鼠CF，观察睾酮对诱导细胞的细胞周期、胶原合成和ERK1/2蛋白磷酸化的影响，为睾酮应用于冠心病心肌纤维化、心室重构的预防及治疗提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 DMEM培养基(Hyclone公司)，新生胎牛血清(杭州四季青公司)，AngⅡ、碘化丙啶(PI)、RNA 酶、睾酮(美国 Sigma公司)，Triton(Amresco 公司)，磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)抗体(美国Cell Signaling公司)，胰蛋白酶(Difco公司)，Ⅱ型胶原酶(Invitrogen公司)，VG染色试剂盒(北京世剂合力公司)，
免疫组化试剂盒、鼠抗波形蛋白单克隆抗体及对氨基联苯胺(DAB)底物显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术服务有限公司)，其他试剂为市售分析纯。

电热恒温干燥箱(上海泸南科学仪器厂，202-1型)，流式细胞仪(COULTER Epics-XP-MCL公司)，CO2培养箱(美国热电Scientific公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司，CK2型)，低温高速离心机(德国Heraeus公司，Biofuge28RS 型)。

1.2 乳鼠CF的原代提取、传代培养及鉴定 1 d龄Wistar乳鼠20只，雌雄不限，由郑州大学实验动物中心提供，动物编号:0008508。

无菌条件下开胸取出心脏，取左心室，将其剪成1 mm3大小的碎块，反复冲洗，加入0.8 g/L胰蛋白酶、0.1 g/LⅡ型胶原酶消化10 min，反复多次，直至组织块消失，收集每次消化液，离心弃上清，加入含体积分数20%胎牛血清的DMEM培养液制成细胞悬液，置于体积分数5%CO2培养箱中37℃培养。

根据心肌细胞和成纤维细胞贴壁时间的不同，差速贴壁2 h，弃上清，待细胞长满瓶壁后用
2.5 g/L胰蛋白酶消化传代。

实验采用第2～3代的细胞，细胞经鼠抗波形蛋白免疫细胞化学染色鉴定为CF。

1.3 实验分组实验分4组，分别用无血清DMEM培养液(对照组)、含 10－
6mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养液(AngⅡ组)、含30 nmol/L睾酮的无血清DMEM培养液(睾酮组)、含30 nmol/L睾酮和10－6mol/L AngⅡ的无血清DMEM培养液(睾酮+AngⅡ组)培养。

1.4 观察指标
1.4.1 细胞周期分布分组培养24 h后，收集细胞，以体积分数70%的乙醇固定，离心去固定液，加入500 μL PI综合染液(PI 5 mg，RNA 2 mg，体积分数
1%Triton 0.25 mL，生理盐水65 mL，加蒸馏水至100 mL，pH 为7.2 ～7.6)室温染色 30 min 后，上流式仪检测。

重复3次。

1.4.2 胶原含量制备CF爬片，待细胞连接成片后，分组培养24 h，倾去培养基，
冲洗，行苏木素染色，冲洗，滴加VG工作液染色，分化、脱水、透明、封片。

切片于倒置相差显微镜下观察并摄片，使用Biosins Digital Imaging Systems测定染色区域积分光密度值，以此表示胶原含量。

重复3次。

1.4.3 p-ERK1/2的表达制备 CF爬片，待细胞连接成片后，分组培养30 min，免疫细胞化学染色法测定p-ERK1/2。

p-ERK1/2抗体稀释200倍，DAB显色，苏
木素复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树脂封片。

切片于倒置相差显微镜下观察并摄片，采用Biosins Digital Imaging Systems测定染色区域积分光密度值，以此表示p-ERK1/2的表达水平。

重复3次。

1.5 统计学处理用SPSS 17.0进行数据分析，采用2×2析因设计的方差分析比较
4组S期细胞比例、胶原含量和p-ERK1/2表达水平，检验水准α=0.05。

2 结果
2.1 CF的鉴定 99%以上的细胞波形蛋白阳性表达(图1)，提示CF分离培养成功。

图1 CF的鉴定(SP，×400)
2.2 4组S期细胞比例的比较见表1。

AngⅡ组S期细胞比例较对照组和睾酮组增加，而睾酮+AngⅡ组S期细胞比例较AngⅡ组明显降低。

表1 4组S期细胞比例的比较(n=3) %FAngⅡ =30.403，P=0.001;F睾酮
=5.812，P=0.042;F交互 =18.073，P=0.003。

AngⅡ 睾酮－+－15.14 ±1.14 18.43 ±0.6832.57 ±4.66 22.73 ±0.31+
2.3 4组胶原含量和p-ERK1/2表达的比较见图2、3 及表 2、3。

图2 4组胶原的表达(VG染色法，×200)A:对照组;B:AngⅡ组;C:睾酮组;D:睾酮
+AngⅡ组。

图3 4组p-ERK1/2的表达(SP，×200)A:对照组;B:AngⅡ组;C:睾酮组;D:睾酮
+AngⅡ组。

表2 4组胶原含量的比较(n=3)FAngⅡ =10.365，P=0.002;F睾酮 =4.533，
P=0.036;F交互 =42.049，P ＜0.001。

AngⅡ 睾酮－+－120.68 ±4.43 118.44 ±3.90150.74 ±3.80 119.50 ±6.93+
表3 4组p-ERK1/2表达水平的比较(n=3)FAngⅡ =174.762，F睾酮=184.828，F交互 =152.240，P 均＜0.001 。

AngⅡ 睾酮－+－115.12 ±7.25 121.85
±4.35+ 130.53 ±10.15 121.85 ±4.35
3 讨论
心肌纤维化主要表现为CF增殖、Ⅰ型和Ⅲ型胶原沉积、细胞外基质蛋白集聚等[8]，是临床多种心脏疾病发生发展的重要病理基础，可致心力衰竭、心律失常、心源性猝死等严重并发症[9]。

AngⅡ通过与细胞上受体结合，经细胞内信号转导通路的
级联反应，最终促进CF生长及胞外基质蛋白的表达，在心肌重构中发挥重要作用[4]。

睾酮是类固醇激素，是男性体内最重要的雄激素，在维持男性性征、免疫功能等方面起重要作用。

自1990年研究发现睾酮对心血管系统有影响后，有关睾酮在心血管疾病影响方面的研究逐渐增多，但目前国内外相关研究结果并不一致。

已证实[9-10]血清睾酮水平降低与心血管事件的发生正相关。

外源性睾酮与心血管不良事件有关[11]。

有研究[12]发现睾酮对心血管系统有保护作用，如抗炎、调节血脂[13]、减轻动脉粥样硬化、扩张血管、保护AngⅡ诱导的血管重塑等[14]。

丝裂素活化蛋白激酶系统(MAPKs)是多种胞外信号向胞内信号传递的汇聚点和共
同通路，是参与AngⅡ生物学效应的重要信号转导通路之一，目前已经确定有 3
条 MAPKs亚通路，ERK1/2是MAPKs亚通路之一，而p-ERK1/2为ERK1/2的
活性形式[15]。

该研究中，作者观察到，10 －6mol/L AngⅡ能明显增加CF的S
期(DNA合成期)细胞比例及胶原合成，同时能明显增强p-ERK1/2的表达，提示AngⅡ能促进CF的增殖，且该效应可能通过ERK1/2通路实现，这与以往的研究[3-4，16]结果相符。

作者还观察到，睾酮+AngⅡ组CF的S期细胞比例及胶原合
成较AngⅡ单独作用组明显下降，p-ERK1/2的表达亦显著降低，提示睾酮可抑制AngⅡ诱导的CF增殖及胶原合成，其机制可能与抑制ERK1/2的活化有关。

综上所述，离体情况下睾酮可抑制AngⅡ诱导的CF的增殖及胶原合成，从而在抑制心肌纤维化中发挥重要作用，该抑制作用可能与抑制ERK1/2信号通路有关。

参考文献
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