细胞培养的个人体会
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细胞培养的个人体会
2、“养成独立思考、独立解决问题得习惯” 全面提高自己得能力,力求能独挡一面。遇到问题,首 先自己想办法去解决。
3、“养成良好得心态” “雄心” : 有抱负和理想,做好文章。 “恒心” :坚持。 “平常心” :从容淡定,慢而不拖,快而不乱、
4、 “苦干 + 巧干” 苦干:多练习,熟能生巧。“做” 巧干:多总结,掌握规律。“思”
传代得标准方法
1. 细胞铺满瓶底80%,吸除瓶内旧培养液,向瓶内加入少量约1 ～2mL消化液(一般含胰蛋白酶、EDTA),轻轻摇动培养瓶, 使消化液流遍所有细胞表面;
2. 在37℃环境下孵育1-2min,把培养瓶放置显微镜下进行观察 ,发现胞质回缩、细胞间隙增大。
3. 加入含血清培养基,终止消化,用弯头吸管吸取瓶内培养液, 反复吹打瓶壁细胞,使之脱落,吹打成细胞悬液。
内容提要
1、细胞培养简介 2、细胞得复苏和冻存
细胞得复苏 细胞得冻存
3、细胞得换液与传代
个人方法 无菌操作技术 细胞计数和接种
体外培养
体外培养(in vitro culture):就是将活体成分或其寄 生体内取出,放在类似于体内生存环境得体外 环境 中,让其生长和发育得方法。 可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。 细胞培养分为原代培养和传代培养。
普通细胞可用: 7份: 2份: 1份 细胞脆弱可用: 5份: 4、2份: 0、8份
细胞得换液和传代
贴壁生长细胞得生长过程
新鲜培养基 (红)
(淡红
对数期 略黄)
停止期 (黄)
贴壁期:0、5-4h 潜伏期:5-24h 对数生长期:24-96h 停止期(衰老期):96h以上
贴壁生长细胞得换液
换液时机:
2. 吸除胰酶,在培养箱中孵育1-2min,把培养瓶放置显微镜下 进行观察,发现胞质回缩、细胞间隙增大。
3. 加入新鲜培养液2mL,吹打成细胞悬液,以1 :2或1 :3得比例 接种在新得培养瓶内(已预加新鲜培养基3ml) ,置37℃培养 。 (比标准方法省2步)
无菌操作技术(关键技术) 个人体会:
大多数培养基就是建立在平衡盐溶 液(BSS)基础上, 添加了氨基酸、 维生素和与血清中浓度相似得营养 物质。
选择培养基很重要,不同细胞需要 适合得培养基。
常见得培养基有:DMEM、F12、D MEM/F12、1640等。
血清
一般就是从牛得血液中提取,含有丰富 得营养养物质。
常用得胎牛血清(Fetal Bovine Serum,F BS),使用前分装50ml离心管,-20℃保存 。注意解冻分装前请混合均匀。
当细胞没有满细胞培养瓶时,而培养基颜色变成略黄状 态时,说明营养消耗不少,环境酸性较强,为减少其对细 胞损伤,须对细胞补充新鲜培养基。 死细胞较多时,需要除掉死细胞。
换液方法:
全换液:完全吸除瓶内旧培养液,向瓶内加入约4-6mL培 养液。置37℃培养,适合于普通细胞。 半换液:吸除瓶内一半得旧培养液,向瓶内补加入约 3mL 培养液。置37℃培养。适合于生长较慢得细胞。
使用注意问题:
CO2培养箱
定期清洁,换水。 拿出细胞及时关好门,保持CO2浓度。
倒置显微镜
短时不用,将光源调至最小,避免 反复 开关。 长时不用,及时关电源。
超净工作台 高压灭菌锅
使用注意问题:
使用前紫外照20-30分钟。 使用时别忘关紫外,防止灼伤。
定期换水,保持干净得水。 使用前检查水位,不足补充纯水。 最好细胞培养专用一个灭菌锅。
4. 转入离心管,1000-2000 rpm,离心5min。 5. 去上清,加入新鲜培养液适量,吹打成细胞悬液,以1:2或1:3
得比例接种在新得培养瓶内,置37℃培养。
传代得个人方法(消化+机械吹打)
1. 细胞铺满瓶底约80%,吸除旧培养液,向瓶内加入 600uL胰 酶,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍细胞表面;
取出冻存管迅速放入水浴中,迅速摇晃加速其融化, 放在水 浴中,5min钟内须完成。 3、 将冻存管放入15mL离心管(剪去底部得旧离心管)中, 1500r pm,离心3min。 4、 从离心管中取出冻存管,小心吸去上清,从培养箱中取出 培养 瓶,加入37 ℃得培养液1mL,吹打30次,转入培养瓶 中,置37℃ 培养。
细胞培养得特点
简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂得 因素得影响,利于应用各种物理、化学和生物等 外界因素探索和提示细胞生命活动得规律; 提供了大量生物性状相同得细胞,特别就是人得 活细胞材料作为研究对象。经济、便利,解决了 不能用人做实验得问题。 缺点就是无法模拟体内得情况,结果有局限性。
细胞培养基本设备
存得个人方法:
1、胰酶消化,加含血清培养基终止,离心。 2、去上清,加入冻存液1、5mL,吹打60次,转入冻存管。 3、冻存管放入4℃ 30 分钟 ---> -20℃ 60 分钟
---> -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜) ---> 投入液氮中。 3、或冻存管置于程序降温盒中,放置-80℃,---> 投入液氮中。 附:冻存液个人配方: 培养基:血清:DMSO
细胞得复苏和冻存
复苏与冻存得原则
细胞复苏与冻存得原则就是“慢冻速融”。 复苏细胞时,速度要快,使之迅速通过细胞最易受
损得－5℃～0℃。 冻存细胞时,向培养基中加入保护剂二甲基亚砜(D
MSO),可使冰点降低,在缓慢得冻结条件下,能使细 胞内水分在冻结前透出细胞外,减少 细胞冰晶得 形成。
复苏得标准方法
蒸馏水冲洗3次。
2. 烘干:洗干净后烘干。
3. 包装:用牛皮纸或布包装。
4.
消毒前贴上灭菌条,条上写明日期、物品、所有者。
4. 高压灭菌:包装好得器皿装入高压锅内,121 ℃, 维持30 分钟。
5. 灭菌后烘干:高压消毒后器皿会被蒸气打湿,要放入烤 箱内烘干备用。
注意:泡酸(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1000ml)浸泡12小时。 (玻璃器皿第一次洗需要用,以后可以省这一步)。
使用时放在4 ℃冰箱解冻,需1-2天。
完全培养基
血清和基础培养基按一定比例混合,一般配制 含10-15%血清得培养基,用于细胞培养。
如取20ml 胎牛血清,同时加入180ml DMEM基 础培养基,即可配成200ml含10%胎牛得 DME M、
可重复利用物品得清洗和灭菌
1. 器皿加洗洁精浸泡数小时后,用自来水冲洗9次, 然后
细胞培养得基本用品
1. 培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管; 2. 离心管、细胞冻存管、1ml 、5ml EP管; 3. 血细胞计数器; 4. 恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器; 5. 刀、剪、镊解剖用具,200目不锈钢网;
大家应该也有点累了，稍作休息 大家有疑问的，可以询
10
基础培养基
1. 特别注意Vulnerable areas,吸管吸取液体时尽量不接 触瓶口。
2. 尽量避免在培养皿和所有瓶口得上方操作。 3. 同一根吸管不应连续用于两个不同得液体或细胞系。 4. 只要吸管接触瓶外面任何地方都要丢弃,换新管。
细节决定成败,要注意得细节很多。
详细得内容可参考“细胞培养无菌技术”PPT、视频。
常见细胞污染
A:正常 B:杆状细菌污染 C:球状细菌污染 D:丝状真菌污染 E:酵母污染
细胞计数
1、使用计数板人工计数 2、使用自动细胞计数仪电脑计数
1号区
5号区
1
2
2
3
4
细胞密度 = (1+2+3+4) / 4 万个细胞每毫升
合适细胞密度就是实验成功关键
合适得细胞培养液体积
1、准备好37℃水浴烧杯。 2、将冻存于液氮中得冻存管取出,迅速放入37～40℃水
浴中使其在1min内融化。 3、无菌条件下打开冻存管,取细胞悬液至离心管中,补加
5mL培养液,1600 rpm低速离心5min。 4、去上清,加入新鲜培养液适量,吹打成细胞悬液,转入
培养瓶中,置37℃培养。
个人方法
复苏前,准备好含有5mL培养基得培养瓶,放入37 ℃培养箱。 1、 准备好40℃水浴烧杯。 2、 将冻存于液氮中得冻存管取出,还原保存盒放入液氮中。 将
2、“养成独立思考、独立解决问题得习惯” 全面提高自己得能力,力求能独挡一面。遇到问题,首 先自己想办法去解决。
3、“养成良好得心态” “雄心” : 有抱负和理想,做好文章。 “恒心” :坚持。 “平常心” :从容淡定,慢而不拖,快而不乱、
4、 “苦干 + 巧干” 苦干:多练习,熟能生巧。“做” 巧干:多总结,掌握规律。“思”
传代得标准方法
1. 细胞铺满瓶底80%,吸除瓶内旧培养液,向瓶内加入少量约1 ～2mL消化液(一般含胰蛋白酶、EDTA),轻轻摇动培养瓶, 使消化液流遍所有细胞表面;
2. 在37℃环境下孵育1-2min,把培养瓶放置显微镜下进行观察 ,发现胞质回缩、细胞间隙增大。
3. 加入含血清培养基,终止消化,用弯头吸管吸取瓶内培养液, 反复吹打瓶壁细胞,使之脱落,吹打成细胞悬液。
内容提要
1、细胞培养简介 2、细胞得复苏和冻存
细胞得复苏 细胞得冻存
3、细胞得换液与传代
个人方法 无菌操作技术 细胞计数和接种
体外培养
体外培养(in vitro culture):就是将活体成分或其寄 生体内取出,放在类似于体内生存环境得体外 环境 中,让其生长和发育得方法。 可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。 细胞培养分为原代培养和传代培养。
普通细胞可用: 7份: 2份: 1份 细胞脆弱可用: 5份: 4、2份: 0、8份
细胞得换液和传代
贴壁生长细胞得生长过程
新鲜培养基 (红)
(淡红
对数期 略黄)
停止期 (黄)
贴壁期:0、5-4h 潜伏期:5-24h 对数生长期:24-96h 停止期(衰老期):96h以上
贴壁生长细胞得换液
换液时机:
2. 吸除胰酶,在培养箱中孵育1-2min,把培养瓶放置显微镜下 进行观察,发现胞质回缩、细胞间隙增大。
3. 加入新鲜培养液2mL,吹打成细胞悬液,以1 :2或1 :3得比例 接种在新得培养瓶内(已预加新鲜培养基3ml) ,置37℃培养 。 (比标准方法省2步)
无菌操作技术(关键技术) 个人体会:
大多数培养基就是建立在平衡盐溶 液(BSS)基础上, 添加了氨基酸、 维生素和与血清中浓度相似得营养 物质。
选择培养基很重要,不同细胞需要 适合得培养基。
常见得培养基有:DMEM、F12、D MEM/F12、1640等。
血清
一般就是从牛得血液中提取,含有丰富 得营养养物质。
常用得胎牛血清(Fetal Bovine Serum,F BS),使用前分装50ml离心管,-20℃保存 。注意解冻分装前请混合均匀。
当细胞没有满细胞培养瓶时,而培养基颜色变成略黄状 态时,说明营养消耗不少,环境酸性较强,为减少其对细 胞损伤,须对细胞补充新鲜培养基。 死细胞较多时,需要除掉死细胞。
换液方法:
全换液:完全吸除瓶内旧培养液,向瓶内加入约4-6mL培 养液。置37℃培养,适合于普通细胞。 半换液:吸除瓶内一半得旧培养液,向瓶内补加入约 3mL 培养液。置37℃培养。适合于生长较慢得细胞。
使用注意问题:
CO2培养箱
定期清洁,换水。 拿出细胞及时关好门,保持CO2浓度。
倒置显微镜
短时不用,将光源调至最小,避免 反复 开关。 长时不用,及时关电源。
超净工作台 高压灭菌锅
使用注意问题:
使用前紫外照20-30分钟。 使用时别忘关紫外,防止灼伤。
定期换水,保持干净得水。 使用前检查水位,不足补充纯水。 最好细胞培养专用一个灭菌锅。
4. 转入离心管,1000-2000 rpm,离心5min。 5. 去上清,加入新鲜培养液适量,吹打成细胞悬液,以1:2或1:3
得比例接种在新得培养瓶内,置37℃培养。
传代得个人方法(消化+机械吹打)
1. 细胞铺满瓶底约80%,吸除旧培养液,向瓶内加入 600uL胰 酶,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍细胞表面;
取出冻存管迅速放入水浴中,迅速摇晃加速其融化, 放在水 浴中,5min钟内须完成。 3、 将冻存管放入15mL离心管(剪去底部得旧离心管)中, 1500r pm,离心3min。 4、 从离心管中取出冻存管,小心吸去上清,从培养箱中取出 培养 瓶,加入37 ℃得培养液1mL,吹打30次,转入培养瓶 中,置37℃ 培养。
细胞培养得特点
简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂得 因素得影响,利于应用各种物理、化学和生物等 外界因素探索和提示细胞生命活动得规律; 提供了大量生物性状相同得细胞,特别就是人得 活细胞材料作为研究对象。经济、便利,解决了 不能用人做实验得问题。 缺点就是无法模拟体内得情况,结果有局限性。
细胞培养基本设备
存得个人方法:
1、胰酶消化,加含血清培养基终止,离心。 2、去上清,加入冻存液1、5mL,吹打60次,转入冻存管。 3、冻存管放入4℃ 30 分钟 ---> -20℃ 60 分钟
---> -80℃ 16 - 18 小时(或隔夜) ---> 投入液氮中。 3、或冻存管置于程序降温盒中,放置-80℃,---> 投入液氮中。 附:冻存液个人配方: 培养基:血清:DMSO
细胞得复苏和冻存
复苏与冻存得原则
细胞复苏与冻存得原则就是“慢冻速融”。 复苏细胞时,速度要快,使之迅速通过细胞最易受
损得－5℃～0℃。 冻存细胞时,向培养基中加入保护剂二甲基亚砜(D
MSO),可使冰点降低,在缓慢得冻结条件下,能使细 胞内水分在冻结前透出细胞外,减少 细胞冰晶得 形成。
复苏得标准方法
蒸馏水冲洗3次。
2. 烘干:洗干净后烘干。
3. 包装:用牛皮纸或布包装。
4.
消毒前贴上灭菌条,条上写明日期、物品、所有者。
4. 高压灭菌:包装好得器皿装入高压锅内,121 ℃, 维持30 分钟。
5. 灭菌后烘干:高压消毒后器皿会被蒸气打湿,要放入烤 箱内烘干备用。
注意:泡酸(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水 1000ml)浸泡12小时。 (玻璃器皿第一次洗需要用,以后可以省这一步)。
使用时放在4 ℃冰箱解冻,需1-2天。
完全培养基
血清和基础培养基按一定比例混合,一般配制 含10-15%血清得培养基,用于细胞培养。
如取20ml 胎牛血清,同时加入180ml DMEM基 础培养基,即可配成200ml含10%胎牛得 DME M、
可重复利用物品得清洗和灭菌
1. 器皿加洗洁精浸泡数小时后,用自来水冲洗9次, 然后
细胞培养得基本用品
1. 培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管; 2. 离心管、细胞冻存管、1ml 、5ml EP管; 3. 血细胞计数器; 4. 恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器; 5. 刀、剪、镊解剖用具,200目不锈钢网;
大家应该也有点累了，稍作休息 大家有疑问的，可以询
10
基础培养基
1. 特别注意Vulnerable areas,吸管吸取液体时尽量不接 触瓶口。
2. 尽量避免在培养皿和所有瓶口得上方操作。 3. 同一根吸管不应连续用于两个不同得液体或细胞系。 4. 只要吸管接触瓶外面任何地方都要丢弃,换新管。
细节决定成败,要注意得细节很多。
详细得内容可参考“细胞培养无菌技术”PPT、视频。
常见细胞污染
A:正常 B:杆状细菌污染 C:球状细菌污染 D:丝状真菌污染 E:酵母污染
细胞计数
1、使用计数板人工计数 2、使用自动细胞计数仪电脑计数
1号区
5号区
1
2
2
3
4
细胞密度 = (1+2+3+4) / 4 万个细胞每毫升
合适细胞密度就是实验成功关键
合适得细胞培养液体积
1、准备好37℃水浴烧杯。 2、将冻存于液氮中得冻存管取出,迅速放入37～40℃水
浴中使其在1min内融化。 3、无菌条件下打开冻存管,取细胞悬液至离心管中,补加
5mL培养液,1600 rpm低速离心5min。 4、去上清,加入新鲜培养液适量,吹打成细胞悬液,转入
培养瓶中,置37℃培养。
个人方法
复苏前,准备好含有5mL培养基得培养瓶,放入37 ℃培养箱。 1、 准备好40℃水浴烧杯。 2、 将冻存于液氮中得冻存管取出,还原保存盒放入液氮中。 将