裸鼠异种移植急性T淋巴细胞白血病模型的建立

急性 Ｔ淋巴细胞白血病 （ａｃｕｔｅＴｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏ ｂｌａｓｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ，ＴＡＬＬ）是一种来源于骨髓的侵袭 性恶性肿瘤［１］。近年来，我国 ＴＡＬＬ发病率呈升高 趋势，部分患者出现耐药和复发等现象导致预后不 佳［２］，因此 ＴＡＬＬ的相关病理机制和药理学研究有 着重要意义。目前对 ＴＡＬＬ疾病发病机制的认识 很大程度上来源于对人体以及原代人 ＴＡＬＬ细胞 的体外研究，在研发治疗 ＴＡＬＬ新药的药理学研究 中，实验动物模型的选择和建立至关重要。目前的
１ 材料与方法
１．１ 主 要 药 物、试 剂 与 仪 器 环 磷 酰 胺 粉 针 剂 （ＣＴＸ，０２ｇ／支）购自安徽医科大学第一附属医院； ＢＶ４２１抗 人 ＣＤ３抗 体 购 自 美 国 ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ公 司； ＣＤ３抗体购自美国 ＳａｎｔａＣｒｕｚ公司；ＴｒｉｔｏｎＸ１００购 自上海碧云天公司；ＥＤＴＡ抗原修复液、Ｈ２Ｏ２、ＤＡＢ 购自北京中杉金桥生物技术有限公司；仪器 Ｏｌｙｍ ｐｕｓ显 微 成 像 系 统 购 自 日 本 Ｏｌｙｍｐｕｓ公 司；Ｃｙｔ ｏＦＬＥＸ型流式细胞仪购自美国贝克曼公司；人白介 素２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ２，ＩＬ２）ＥＬＩＳＡ试剂盒购自南京优 宜佳生物 科 技 有 限 公 司；ＴｅｃａｎＩｎｆｉｎｉｔｅＭ１０００酶 标 仪购自瑞士 ＴＥＣＡＮ公司。 １．２ 细胞来源与培养 人 Ｊｕｒｋａｔ细胞株购于美国 ＡＴＣＣ细胞库，将 Ｊｕｒｋａｔ细胞置于 １０％灭活胎牛血 清、１％ 双 抗 的 ＲＰＭＩ１６４０培 养 液 中，然 后 放 入 ３７℃、５％ ＣＯ２恒温培养箱中培养［７］。 １．３ 实验动物 ４０只雌性 ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠，５周龄， 体质量 １７～２０ｇ，购自江苏集萃药康生物科技有限 公司［ＳＰＦ级，合格证号：ＳＣＸＫ（苏）２０１８０００８］。 １．４ ＴＡＬＬ白血病细胞移植 将 ４０只裸鼠随机 分为正常组（ｎ＝１０）、尾静脉移植组 （ｎ＝１５）和皮 下移植组（ｎ＝１５）。粉针剂环磷酰胺用灭菌 ０９％ 氯化钠溶液稀释成浓度为 ２０ｍｇ／ｍｌ的溶液，腹腔注 射 ＣＴＸ２ｍｇ／只，连续注射 ２ｄ；第 ３天收集处于对 数生长 的 Ｊｕｒｋａｔ细 胞，调 整 细 胞 密 度 至 ２５×１０７ 个 ／ｍｌ。尾静脉移植组裸鼠，尾静脉缓慢注射无菌 Ｊｕｒｋａｔ细胞 ５×１０６个 ／只（０２ｍｌ），连续注射２ｄ；皮 下移植组裸鼠，于裸鼠颈背皮下注射无菌 Ｊｕｒｋａｔ细 胞 ５×１０６个 ／只（０２ｍｌ），连续注射 ２ｄ。 １．５ 动物饲养 所有裸鼠饲养在层流架上无菌独 立送风隔离 ＩＶＣ笼中，与其接触的物品、饲料和饮 用水均须灭菌处理。ＳＰＦ条件下饲养 １周后正常组 裸鼠尾静脉注射 ０２ｍｌ无菌 ＰＢＳ，其余两组分别采
测肝脏和脾脏中浸润的 Ｊｕｒｋａｔ细胞表达，ＥＬＩＳＡ检测血清中 Ｊｕｒｋａｔ细胞分泌 ＩＬ２水平。结果 与正常组相比，尾静脉移 植组和皮下移植组裸鼠均逐渐出现体质量下降、弓背、食欲 减退等表现，肝脏、脾脏及骨髓中均有人 Ｊｕｒｋａｔ细胞表达。 尾静脉移植组成模率 ７３％，皮下移植组成模率 ４０％。结论 尾静脉注射和皮下注射异种移植 Ｊｕｒｋａｔ细胞两种方法均 可成功建立急性 Ｔ淋巴细胞白血病动物模型，尾静脉注射移 植效果更佳。 关键词 急性 Ｔ淋巴细胞白血病细胞；ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠；异种 移植；动物模型；尾静脉注射；皮下注射 中图分类号 Ｒ７３３５；Ｒ７３３５２ 文献标志码 Ａ 文章编号 １０００－１４９２（２０２１）０６－０９０８－０７ ｄｏｉ：１０．１９４０５／ｊ．ｃｎｋｉ．ｉｓｓｎ１０００－１４９２．２０２１．０６．０１４
２０２１－０３－３０接收 基金项目：国家自然科学基金（编号：８１９７３３３２、８１６０３１２１） 作者单位：安徽医科大学临床药理研究所，抗炎免疫药物教育部重点
实验 室，抗 炎 免 疫 药 物 安 徽 省 协 同 创 新 中 心，合 肥 ２３００３２ 作者简介：张爱君，女，硕士研究生； 魏 伟，男，博士，教授，博 士 生 导 师，责 任 作 者，Ｅｍａｉｌ： ｗｗｅｉ＠ａｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ； 吴育晶，女，博士，副教授，硕士生导师，责任作者，Ｅｍａｉｌ： ｗｙｊ＠ａｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
裸鼠异种移植急性 Ｔ淋巴细胞白血病模型的建立
张爱君，潘文文，胡晓曦，吴育晶，魏 伟
摘要 目的 比较尾静脉注射和皮下注射人 Ｊｕｒｋａｔ细胞建 立异种移植急性 Ｔ淋巴细胞白血病模型的优缺点。方法 雌性 ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠随机分为正常组、尾静脉移植组和皮下移 植组。除正常组外，其余裸鼠造模前连续 ２ｄ给予环磷酰胺 （２ｍｇ／只），尾静脉移植组连续 ２ｄ尾静脉 接 种 ５×１０６ 个 Ｊｕｒｋａｔ细胞，皮下移植组连续 ２ｄ皮下接种 ５×１０６ 个 Ｊｕｒｋａｔ 细胞，正常组裸鼠尾静脉注射相同体积 ＰＢＳ缓冲液。观察 并记录裸鼠体质量、弓背以及精神状态。第 ７天和第 １４天 通过流式细胞术检测 Ｊｕｒｋａｔ细胞在裸鼠外周血中浸润情况。 第 ２８天待尾静脉移植组和皮下移植组裸鼠出现衰竭体征濒 临死亡时处死裸鼠，记录裸鼠体质量，瑞氏 －吉姆萨染色检 测外周血和骨髓中 Ｊｕｒｋａｔ细胞的浸润情况，流式细胞术检测 脾脏和骨髓中 Ｊｕｒｋａｔ细胞的百分比，ＨＥ染色、免疫组化法检
安徽医科大学学报 ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ ２０２１Ｊｕｎ；５６（６）
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白血病动物模型包括异种移植性白血病、自发性白 血病、诱发性白血病和转基因动物模型，其中异种移 植性白血病模型较为常用，多选用 ＢＡＬＢ／ｃ裸鼠［３］ 造模。ＴＡＬＬ动物模型的建立除了动物种类，移植 途径的选择 也 很 重 要 ［４－６］。 因 此，为 了 建 立 操 作 简 便、经济可靠、重复性好和观察指标明确的 ＴＡＬＬ 模型，该文 将 通 过 比 较 尾 静 脉 移 植 和 皮 下 移 植 人 Ｊｕｒｋａｔ细胞建立异种移植 ＴＡＬＬ裸鼠动物模型的优 缺点，为研究 ＴＡＬＬ的发病机制以及相关新药的研 发奠定实验基础。
第 ２８天颈椎脱臼处死裸鼠后，取出脾脏充分研 磨，获取的脾脏细胞用 ５０μｌＰＢＳ重悬混匀，同法加 入抗体孵育后用流式细胞仪检测。取得的骨髓细胞 用 ５０μｌＰＢＳ重悬混匀，同法加入抗体孵育后流式 细胞仪检测。通过检测各组裸鼠脾脏和骨髓细胞中 人 ＣＤ３＋细胞百分比，反映裸鼠脾脏和骨髓细胞中 Ｊｕｒｋａｔ细胞浸润情况。 １．９ 外周血和骨髓瑞氏 －吉姆萨染色 取第 ２８天 裸鼠新鲜的抗凝全血 １滴（约 ５μｌ），置于干净载玻 片的一端 １ｃｍ处，左手持载玻片，右手持推片从血 滴前方后移接触血滴，使血滴沿、匀速、平稳地向前移动推制 成血涂片，滴加瑞氏 －吉姆萨染液，染色 １ｍｉｎ，再将 磷酸盐缓冲液滴加于瑞氏 －吉姆萨染液上，以洗耳 球吹出微风使液面产生涟漪状，使两液充分混合，染 色 ３～１０ｍｉｎ，流水冲洗，待干，镜检。剪掉裸鼠大腿 上的皮肤和肌肉，暴露股骨及两端相连的关节，然后 从股骨两端关节头处取下股骨，剪断股骨一端，用抽 有 ０９％氯化钠溶液的 １ｍｌ注射器插入骨髓腔深 处，将冲出的骨髓液用 ２００目纱网过滤，ＰＢＳ溶液冲 洗 １遍后，取 １０μｌ左右进行瑞氏 －吉姆萨染色，在 光学显微镜下计数 ２００个有核细胞，计算其中 Ｊｕｒ
ｏｆＯＲＰ８ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｏｒＯＲＰ８ｓｉＲＮＡｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒＤＬＤ１ｃｅｌｌ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅｏｒｏｖｅｒｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｎｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＤＬＤ１ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＣＣＫ８ｔｅｓｔ， ｔｒａｎｓｗｅｌｌｔｅｓｔａｎｄｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇｔｅｓｔ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｗａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆ ＯＲＰ８ｉｎｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｓ（ＥＲＫ１／２）ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉ ｔｉｏｎ（ＥＭＴ）ｒｅｌａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓｐｒｏｔｅｉｎＥｃａｄｈｅｒｉｎ，ＮｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎａｒｅｓｔｕｄｉｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｉｎ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＤＬＤ１，ｗｈｅｎＯＲＰ８ｗａｓｓｉｌｅｎｃｅｄ，ｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜００１），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍａｒｋｅｒＥｃａｄｈｅｒｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｍａｒｋｅｒＶｉｍｅｎｔｉｎａｎｄＮｃａｄｈｅｒｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐＥＲＫ１／２ａｌｓｏｉｎ ｃｒｅａｓｅｄ．Ｏｎｔｈｅｃｏｎｔｒａｒｙ，ｗｈｅｎＯＲＰ８ｗａｓｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ，ｔｈｅｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｃａｐａｃｉｔｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍａｒｋｅｒＥｃａｄｈｅｒｉｎｉｎｃｒｅａｓｅｄ（Ｐ＜００１、Ｐ＜００１、Ｐ＜ ００５），ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｓｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｍａｒｋｅｒＮｃａｄｈｅｒｉｎａｎｄＶｉｍｅｎｔｉｎｐｒｏｔｅｉｎｄｅｃｒｅａｓｅｄ，ａｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓ ｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆｐＥＲＫ１／２ａｌｓｏｄｅｃｒｅａｓｅｄ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ ＯＲＰ８ｐｒｏｔｅｉｎｃａｎｉｎｈｉｂｉｔｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎ ｖａｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＤＬＤ１，ａｎｄｉｔｓｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｍａｙｂｅｒｅｌａｔｅｄｔｏｂｌｏｃｋｉｎｇＥＭＴｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎｏｆｐＥＲＫ１／２． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ ＯＲＰ８；ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ；ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ；ｍｉｇｒａｔｉｏｎ；ｉｎｖａｓｉｏｎ
取尾静脉移植和皮下移植进行细胞移植。 １．６ 观察记录 每天观察裸鼠进食、行动、弓背及 精神情况；每周记录 １次体质量。裸鼠出现明显消 瘦、弓背、精神萎靡、体质量下降 ２０％时视作濒死状 态。 １．７ 标本采集及处理 分别在造模第 ７天和第 １４ 天时裸鼠尾部取血 ２０μｌ，进行流式细胞术检测并挑 选出造模成功裸鼠。造模第 ２８天裸鼠出现明显消 瘦、弓背、体质量下降超过 ２０％，眼球取血后颈椎脱 臼法处死并取出裸鼠肝、脾组织，取部分脾脏轻轻研 磨，制成单细胞悬液用于流式细胞术检测，剩余组织 置于 ４％的多聚甲醛中常温保存。 １．８ 流 式 细 胞 术 检 测 裸 鼠 外 周 血、脾 脏 和 骨 髓 中 Ｊｕｒｋａｔ细胞 分别将第 ７天和第 １４天时取的 ２０μｌ 外周血，用红细胞裂解液完全裂解后离心得细胞沉 淀，然后向细胞沉淀中加入 ５０μｌＰＢＳ重悬混匀，加 入检测所需抗人 ＣＤ３流式抗体，混匀后 ４℃避光孵 育 ３０ｍｉｎ。清洗 １次后流式细胞仪上机检测 Ｊｕｒｋａｔ 细胞在裸鼠外周血中的百分比。以裸鼠外周血中有 Ｊｕｒｋａｔ细胞表达为造模成功。根据 Ｊｕｒｋａｔ阳性裸鼠 数量计算造模成功率，挑出造模成功裸鼠进行后续 实验。
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安徽医科大学学报 ＡｃｔａＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｉｓＭｅｄｉｃｉｎａｌｉｓＡｎｈｕｉ ２０２１Ｊｕｎ；５６（６）
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