Frat与β-连环素在肺癌中的表达及与临床病理因素的关系

Frat与β-连环素在肺癌中的表达及与临床病理因素的关系栾岚;张勇;郭宁;王恩华
【摘要】背景与目的 Frat(frequently rearranged in advanced T-cell lymphomas)是Wnt(wingless/int)信号传导途径的正向调节因子,通过结合糖原合成酶激酶3(glycogen synthase kinase,GSK3),抑制GSK3依赖的磷酸化作用,从而阻止β-连环素(β-catenin)的降解,β-catenin通过与TCFs(T cell factors)结合而激活靶基因.本研究的目的是探讨Frat和β-catenin在肺癌中的表达及其与各临床病理因素的关系.方法采用组织芯片和免疫组织化学法检测52例肺癌标本中Frat和β-catenin的表达.结果 Frat的阳性表达率为75.00%,其中高分化,中分化和低分化非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中Frat的阳性率分别为41.67%5/12),83.33%(15/18)和88.24%(15/17),差异有统计学意义
(X2=9.229,P=0.01).β-catenin的细胞表达异常率为71.15%,高分化,中分化和低分化NSCLC中β-catenin的表达异常率分别为41.67%(5/12),61.11%(11/18)和100%(17/17),差异有统计学意义(X2=12.601,P=0.002).结论β-catenin的细胞表达异常与NSCLC的低分化正相关,Frat的表达与NSCLC的低分化和β-catenin的表达异常正相关.
【期刊名称】《中国肺癌杂志》
【年(卷),期】2008(011)001
【总页数】5页(P62-66)
【关键词】Frat;β-catenin;肺肿瘤
【作者】栾岚;张勇;郭宁;王恩华
【作者单位】沈阳医学院奉天医院病理科;110001,沈阳,中国医科大学基础医学院
病理教研室;辽宁医学院附属第一医院;110001,沈阳,中国医科大学基础医学院病理
教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R734.2
Wnt信号传导途径由一系列癌基因和抑癌基因编码的蛋白质组成，是传递生长刺
激信号的通路，它对控制胚胎发育起重要作用，而其不恰当的活化参与多种人类癌症的发病过程[1]。

β-连环素（β-catenin）同时是Wnt信号传导通路和上皮钙黏
素-连环素复合体的关键分子。

当β-catenin在细胞核内蓄积时，能激活Wnt信号传导通路，启动靶基因转录，如c-myc，cyclinD1，c-jun等，导致细胞增殖，最终致使细胞发生癌变[2]。

Frat是Wnt信号传导途径的正向调节因子，通过与糖原合成酶激酶3（GSK3）结合，抑制GSK3依赖的磷酸化作用，从而使β-catenin
水平升高，β-catenin通过与TCFs结合而激活靶基因[3]。

目前，Frat在肺癌组织中的表达尚无报道，肺癌中Frat与β-catenin异常表达的关系及意义尚不清楚。

我们拟探讨肺癌中Frat和βcatenin表达，并与临床病理因素的关系，以及它们与NSCLC组织学分型，分化的关系。

1 材料与方法
1.1 材料 52例肺癌的组织芯片购自桂林泛谱生物技术有限公司。

患者平均年龄58.17岁（27-80岁），男：女比例为 1.89：1（34：18），按 WHO（2003）
肺肿瘤组织学分类标准：鳞癌18例，腺癌25例，小细胞肺癌5例，腺鳞癌3例，大细胞癌1例；NSCLC中高分化12例，中分化18例，低分化17例。

依据国际抗癌联盟（UICC）1997年修订的肺癌P-TNM分期标准：Ⅰ期43例，Ⅱ期6例，
Ⅲ期3例，Ⅳ期0例。

羊抗鼠Frat多克隆抗体（sc-8445）购自Santa Cruz生物技术公司；鼠抗人β-catenin单克隆抗体，SP超敏免疫组织化学试剂盒和DAB
酶底物显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。

图1 高分化肺腺癌β-catenin细胞膜表达减弱的同时出现胞浆表达（SP 法，原始放大倍数×200）Fig1 Reduced staining of β-catenin on membrane with cytoplasmic accumulation in well differentiated lung adenocarcinoma(SP method,original magnification×200)
1.2 方法免疫组织化学法组织芯片标本经脱蜡，脱苯，水化后，采用链菌素抗生
物素蛋白-过氧化物酶法（SP）检测β-catenin蛋白和Frat蛋白表达，一抗为鼠抗人β-catenin单克隆抗体（即用型）和羊抗鼠Frat多克隆抗体（1：50），以磷
酸盐缓冲液（Phosphate Buff er Saline，PBS）代替一抗作为阴性对照。

结果判定：βcateni n在正常上皮组织中阳性表达定位于细胞膜，极少有异位表达。

每例
随机选取10个高倍视野，每个视野计数100个瘤细胞，计数阳性细胞百分比。

膜阳性瘤细胞数≤90%为表达降低，＞90%为表达正常。

20%以上瘤细胞胞质和（或）核染色为胞质或核表达。

出现胞质和（或）胞核表达为异位表达，异位表达和表达降低统归为异常表达[4]。

Frat阳性表达定位于细胞质，偶有细胞核表达。

按阳性
细胞百分数及染色强度计分，阳性细胞数为0计0分；1%-25%计1分；26%-50%计2分；＞50%计3分，染色阴性计0分；淡黄色计1分；棕黄色计2分；棕褐
色计3分。

两种积分相加，积分为0-2分，表示阴性（-）；积分为 3-4 分，表示阳性（+）；积分为 5-6 分，表示强阳性（⧺），后两者均视为阳性表达。

1.3 统计学分析应用SPSS for Windows 13.0统计分析软件进行数据处理，采用Pearson卡方检验分析β-catenin与Frat表达的关系及它们与临床病理特征的关系。

2 结果
2.1 β-catenin的表达β-catenin细胞表达异常率为71.15%（图1，2）。

低分化NSCLC中β-catenin的表达异常明显高于中，高分化的病例，中分化的病例高于高分化的病例（χ2=12.601,P=0.002）。

β-catenin 的表达异常率与患者年龄（P=0.571），性别（P=0.603），肿瘤类型（P=0.366）和 TNM 分期
（P=0.280）无关（表1）。

图2 中分化肺鳞癌癌细胞浆内β-catenin表达（SP法，原始放大倍数×200）Fig2 Expression of β-catenin in cytoplasm in moderately differentiated lung squam Ous ce ll carcinoma(SP method,original magnification×200)
表1 β-catenin表达与临床病理参数的关系Tab1 Relationship between the expression of β-catenin and the clinicopathological characteristicsβ-catenin characteristic Membranous expression Abnormal cell expression Abnormal cell Expression rate（%） P value Age(year) 0.571＜58 9 19 67.86≥58 6 18 75 Sex 0.603 Male 9 25 73.53 Female 6 12 66.67 P-TNM 0.280Ⅰ12 31 72.09Ⅱ3 3 50.00Ⅲ0 3 100.00 Differentiation 0.002 Well 7 5 41.67 Moderately 7 11 61.11 Poorly 0 17 100.00 Histology 0.366 Squamous cell carcinoma 3 15 83.33 Adenomcarcinoma 9 16 64.00 others 3 6 66.67 2.2 Frat的表达 Frat的阳性表达率为75%（图3，4）。

低分化NSCLC中Frat的表达高于中分化和高分化的病例，中分化病例的Frat表达高于高分化的病例
（χ2=9.229,P=0.01）。

Frat与β-catenin 的细胞表达异常正相关(χ2=5.278，P ＜0.05），但 Frat的阳性表达率与患者年龄（P=1.000），性别（P=0.736），肿瘤类型（P=0.571）和 TNM 分期（P=0.541）无关（表2）。

图3 中分化肺腺癌癌细胞浆内Frat过表达（SP法，原始放大倍数×200）Fig3 Overexpression of Frat in cytoplasm in moderately differentiated lung adenoca rcinoma(SP method,original magnification×200)
图4 低分化肺鳞癌癌细胞浆内Frat过表达（SP法，原始放大倍数×200）Fig4 Overexpression of Frat in cytoplasm in poorly differentiated lung squamous cell carcinoma(SP method,original magnification×200)
表2 Frat表达与β-catenin和临床病例参数的关系Tab 2 Relationship between the expression of Frat andβ-catenin and the clinicopathological characteristicsFrat characteristics negative positive Positive expression rate （%）P value β-catenin 0.022 Membranous expression 7 8 53.33 Abnormal cell expression 6 31 83.78 Age(year)1.000＜58 7 21 75.00≥58 6 18 75.00 Sex 0.736 Male 9 25 73.53 Female 4 14 77.78 P-TNM 0.541Ⅰ11 32 74.42Ⅱ2 4 66.67Ⅲ0 3 100.00 Differentiation 0.010 Well 7 5 41.67 Moderately 3 15 83.33 Poorly 2 15 88.24 Histology 0.571 Squamous cell ca rcinoma 5 13 72.22 Adenomcarcinoma 7 18 72.00 others 1 8 88.89
3 讨论
β-catenin是上皮钙黏素-连环素复合体的关键分子，参与调节同种细胞间的黏附。

同时，游离的βcatenin也是Wnt信号传导途径的重要分子，它可通过核膜进入
到细胞核内，与DNA亲合蛋白LEF/TCF（lymphoid enhancer factor/T cell factor）结合，激活 Wnt途径靶基因，如c-myc，cyclinD1等，调节细胞增殖，参与肿瘤形成[5]。

β-catenin在各种肿瘤中的表达率有很大差异，这可能是由于肿瘤类型和判定标准不同。

本研究显示，肺癌中β-catenin异常表达率为71.15%，其中高分化癌中可见到β-catenin正常表达多于中分化癌，而低分化癌多表现为β-catenin细胞膜
表达减弱，缺失并出现细胞质或核的表达。

β-catenin的异常表达率与临床分期无关，此结果与徐洪涛等[6]对100例NSCLC的研究结果相似。

β-catenin异常表达的原因很多，除了基因突变[7]，β-catenin降解过程的任何异
常都有可能导致其异常表达和蓄积，所以GSK-3及大肠腺瘤样息肉蛋白（adenomatous polyosis coli，APC）等介导β-catenin 降解的关键蛋白的异
常都可能是β-catenin异常表达的重要原因。

Frat是GSK3的结合蛋白，当Wnt信号途径被激活时，卷曲蛋白（Frizzled，Frz）能激活散乱蛋白（Dishevelled，Dvl），Dvl再激活下游因子 Frat，激活的 Frat
能识别并抑制GSK3的磷酸化活性，使GSK3不能磷酸化β-catenin，导致β-catenin不能被泛素识别，从而不能被蛋白酶复合体降解。

Frat最初被证实是T细胞淋巴瘤的原癌基因，它在爪蟾的同源物GBP（GSK3 binding protein）作为GSK3结合蛋白被分离出后，人们才知道Frat也是Wnt
信号传导通路的重要组成部分[8]。

人类Frat家族包括Frat1和Frat2，它们的基
因均定位于第10条染色体的长臂上（10q24.1），之间仅相差10.7kb[9]。

Frat1分子量为29KD，由279个氨基酸构成。

Frat2分子量为24KD，由233个氨基酸构成。

Frat1与Frat2有77%的氨基酸构成相同，它们在酸性区有更高的同源性，达到96%，富含脯氨酸区可达到92%，而与GSK3结合区的氨基酸是100%相同的，因此，Frat2，与Frat1一样，是Wnt信号转导通路的正向调节因子[10]。

Dajani Rana等人认为当GSK3与Frat/GBP结合时，使GSK3脱离Axin（轴蛋白）-APC复合体，从而阻止它接近βcatenin，也就是说GSK3活性被Axin与Frat/GBP竞争性结合所调节[11]。

Frat与GSK3结合是通过被Wnt信号激活的Dvl[12]。

而Dvl与Frat的结合也受到丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（casein kinase Iε，CKIε）的调控[13]。

Frat不但能与GSK3结合，Jonathan等人认为Frat还可能
是GSK3核输出定位的内在因子[14]，对于控制GSK3与底物结合有重要意义。

Saitoh等人研究了原癌基因Frat1在人类癌症中的表达，它在胃癌，胰腺癌中都
有表达[15]，在食管癌，宫颈癌中以及乳腺癌中表达相对高一些 [16]。

本研究显示，肺癌中Frat的阳性表达率为75%，在肺癌各组织类型中表达无显著差异。

NSCLC
中，Frat在低分化病例中的表达高于中分化和高分化，在中分化病例中的表达高于高分化病例，差异具有统计学意义（P=0.01）。

本实验中，Frat的表达还与βcatenin的异常表达正相关。

这些对进一步了解肺癌的发生，发展及预后都有一定的意义。

Frat的表达在TNMⅠ期，Ⅱ期与Ⅲ期间没有差异，这可能与本实验采用的Ⅱ期，Ⅲ期病例数较少有关，所以这一结论并不肯定，有待今后扩大病例数进一步证实。

综上所述，β-catenin的异常表达与NSCLC的低分化正相关，Frat的表达与NSCLC的低分化和β-catenin的异常表达正相关。

参考文献
【相关文献】
1 Bienz M,Clevers H.Linking colorectal cancer to Wnt signaling.Cell.2000,103(2):311-320.
2 Lim SC,Lee MS.Significance of E-cadherin/beta-catenin complex and cyclinD1 in breast cancer.Oncol Rep,2002,9(5):915-928.
3 Karim R,Tse G,Putti T,et al.The significance of the Wnt pathway in the pathology of human cancers.Pathology,2004,36(2):120-128.
4 Xu HT,Lin D,Wa ng L,et al.The study of expression and mutation of β-catenin in NSCLC.Chin J Lung Cancer,2004,7(5):409-413.[徐洪涛，林东，王亮，等.β-catenin在NSCLC 中的表达和突变研究.中国肺癌杂志,2004,7(5):409-413.]
5 Lin D,Wang EH,Zhang ZK,et al.The expression and significance of β-catenin in non-small cell lung cancer.Chin Journal of pathology,2003,32（1）:54-55.[林东,王恩华,张志坤,等.磷酸化的β-catenin 在非小细胞肺癌中的表达及意义.中华病理学杂志,2003,32（1）:54-55.]
6 Xu HT,Wang L,Lin D,et al.The relationship between Axin and abnormal expression of β-catenin in non-small cell lung cancer.Chin Journal of pathology,2005,34(8):519-523.[徐洪涛,王亮,林东,等.非小细胞肺癌中Axin与β-连环素异常表达的关系.中华病理学杂志,2005,34(8):519-523.]
7 Clements WM,Wang J,SarnaiK A,et al.Beta-catenin mutation is a frequent cause of Wnt pathway activation in gastric cancer.Cancer Res,2002,62(12):3503-3506.
8 YostC,FarrGH,Pierce SB,et al.GBP,an inhibitor of GSK3,is implicated in Xenopus
development and Oncogenesis.Cell,1998,93(6):1031-1041.
9 Freemantle SJ,Portland HB,Ewings K,et al.Characterization and tissue-specific expression of human GSK3-binding proteins FRAT1 and FRAT2.Gene,2002,291(1-2):17-27.
10 Saitoh T,Moriwaki J,Koike J,et al.Molecular cloning and characterization of
FRAT2,encoding a positive regulator of the WNT signaling pathway.Biochem Biophys Res Commun,2001,281(3):815-820.
11 Dajani R,Fraser E,Roe SM,et al.Structural basis for recruitment of glycogen synthase kinase3 to the Axin-APC scaffold complex.The EMBO J,2003,22(3):494-501.
12 Salic A,Lee E,Mayer L,et al.Control of beta-catenin stability reconstitution of the cytoplasmic steps of the Wnt pathway in Xenopus egg extracts.Mol Cell.2000,5(3):523-532.
13 Shin-ichiro H，Tatsuo M,Makoto A,et al.Casein Kinase I Enhances the Binding of dvl1
to frat1 and Is Essential for Wnt-3-induced Accumulation of beta-catenin.JBiol
Chem,2003,278(16):14066-14073.
14 Jonathan Franca-Koh,Margaret Y,Elizabeth F,et al.The regulation of GSK3 nuclearexport by Frat/GBP.J Biol Chem,2002,277(46):43844-43848.
15 Saitoh T,Katoh M.FRAT1 and FRAT2,Clustered in human chromosome
10q24.1region,are up-regulated in gastric cancer.Int J Ncol,2001,19(2):311-315.
16 Saitoh T,Mine T,Katoh M.Molecular cloning and expression of proto-concogene FRAT1 in human cancer.Int J Oncol,2002,20(4):785-789.。