微机模拟蛋白质纯化实验报告

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微机模拟蛋⽩质纯化实验报告
微机模拟蛋⽩质纯化实验
⼀、实验⽬的:
1. 了解模拟⽣化⼲实验的⽅法和意义,掌握⽤protein软件提纯蛋⽩质的⽅法。

2. 进⼀步熟悉层析、热变性、盐析等常⽤⽣化分离⽅法的原理和应⽤。

⼆、实验原理:
“Protein”软件有36个任务,即36组待分离纯化的蛋⽩。

任务要求利⽤软件提供的⼏种实验技术,提纯每⼀个⽬的蛋⽩,最终达到单向电泳⼀条带,双向电泳⼀个点,⽽且使⽤的⼈时和经费(根据提取步骤计算得到)不得超过⼀个特定值。

在每个任务开始时,软件给出⽬的蛋⽩的⼀些性质,如热稳定的温度范围和pH稳定范围等,利⽤这些信息,可以使实验少⾛弯路。

“Protein”提供的分离纯化⽅法有七种:①热变性;②硫铵沉淀;③排阻层析(凝胶⾊谱);④离⼦交换层析;⑤吸附层析;⑥聚焦层析;⑦制备电泳。

在“Protein”所提供的各种分离纯化⽅法中,热变性法和盐析法是⽐较好的粗提⽅法,在提纯的早期使⽤效果较好。

层析是各种⽅法中最强有⼒的⽅法,制备电泳虽然纯化倍数⾼,但是回收率低。

在各种层析⽅法中,⼜以离⼦交换层析最为有效和易于使⽤,并且耗费的⼈时和经费也较少。

排层层析和聚焦层析耗费较⼤,但在某些特定情况下,这两种⽅法是不可替代的。

“Protein”提供了四种电泳⽅法:即,SDS-PAGE、PAGE、等电聚焦电泳和双向电泳。

这些电泳⽅法不但可以⽤以检测样品的纯度,⽽且也给出了样品的⼀些信息,如分⼦量、等电点等,这些信息对于后续提纯有重要的参考价值,等电聚焦电泳和PAGE还可以⽤于制备。

本实验要求完成实验软件中三种酶的分离纯化。

1 酸性条件下稳定的蛋⽩(Windows 3号酶)
3号酶在62℃以下稳定,稳定pH范围3.8~5.8(酸性条件)。

分离纯化步骤:
1 热变性:⽔浴温度61℃,⽔浴时间60min
2 离⼦交换:
然后进⾏PAGE和SDS-PAGE检测
结果分析:在检测时出现两条带的时候可能是由于蛋⽩质的含有两个亚基。

PI⼤概为5.6。

左右
2碱性条件下的稳定的蛋⽩(Windows 5号酶)
1热变性发
2离⼦交换
3电泳结果
4:page和sds-page检测
结果分析:PI⼤约为7.0。

检测结果发现两条提纯结果不是很理想⽩⾊条。

2 碱性条件下稳定的蛋⽩(Windows 30号酶)
30号酶在52℃以下稳定,稳定pH范围5.5~10.1(碱性条件)。

分离纯化步骤:
1 热变性:⽔浴温度51℃,⽔浴时间60min
2 硫铵沉淀:初始百分饱和度20%,终末百分饱和度65%(质量分数),收集沉淀组分
3 离⼦交换层析:
填料DEAE-Sephadex A-50,柱长:10cm,柱内径:2.0cm,缓冲体系:磷酸氢⼆钠-Citrate (2.2-8.0),pH 6.4,流速:0.3ml/min,离⼦强度梯度洗脱:0.01mol/L-0.15mol/L,洗脱体积:300ml。

收集从77—100管的样品进⾏⼆维电泳分析:
因杂质蛋⽩与⽬标蛋⽩Mr相差较⼤,可⽤凝胶层析进⾏进⼀步分离
D)凝胶层析:
填料Sephadex G-75,柱长:100cm,柱内径:2.0cm,缓冲体系:磷酸氢⼆钠-Citrate (2.2-8.0)pH 6.4,浓度
0.02mol/L,流速:0.3ml/min,
收集后进⾏如下检测:
检测纯化结果:
A)⼆维电泳,pH 3~10,分离胶浓度20%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数)
已达到⼀个点的要求。

B)PAGE:分离胶浓度10%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数),缓冲体系:磷酸⼆氢钾-NaOH,pH 8.0
⽤PAGE检验,已达到⼀个点的要求,作为对⽐再⽤SDS-PAGE检验。

C)SDS-PAGE:分离胶浓度20%(体积分数),浓缩胶浓度3%(体积分数),
SDS-PAGE检验结果显⽰,有⼀条带。


实验结果分析:
提纯效果⽐上两个好,只有⼀条⽩条。

此蛋⽩质的PI约为6.8。

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