口腔生物学实验教程

第一节 口腔微生物学实验
实验一 菌斑的采集、染色和观察、分类 实验目的与要求:
掌握牙菌斑标本的采集、处理和常用染色——刚果红（congo red）负性染色的主要程 序和方法，熟悉龈上或龈下菌斑中常见细菌的形态及分类方法。 实验内容: 菌斑标本的采集；细菌涂片的制备、染色；染色细菌的观察及 Listgarten分类。 实验设备和器材等用品： 香柏油，二甲苯，菌斑染色剂，酒精，浓盐酸和灭菌的液状石蜡等。 无菌牙科镊子、挖匙或探针（龈上菌斑检查用），载玻片，灭菌取菌环可卸式取菌器 或消毒滤纸（龈下菌斑采集用），含预还原转送培养基的带盖小瓶，普通光学显微镜， 试镜纸，细菌接种环及装有固体培养基的培养皿等。
注意事项： 实验前要用流动相平衡分析柱； 注意温度对分析结果有影响。
实验报告与评定：细菌代谢酸测定。 思考题： 色谱层析实验中哪些方面非常重要？ 细菌代谢酸的测定除了采用色谱层析技术以外，还可以用哪些方法测定？
第一节 口腔微生物学实验
实验四 细菌细胞外葡聚糖的测定
实验目的与要求： 变异链球菌可以产生葡糖基转移酶，综合蔗糖产生细胞外多糖即水溶性或不溶水葡聚 糖。通过实验要掌握用比色法测定葡聚糖含量的方法和原理。
实验目的与要求： 学习用色谱技术定性和定量检测分析细菌代谢脂肪酸的基本方法。
实验原理： 各种脂肪酸在色谱柱（固定相）及流动相中的分配系数、吸附能力不同，导致它们在 柱中的保留时间有所差异。同种酸停留时间相同；峰面积与含量正相关。
实验内容： 1.液体纯培养增菌。 2.色谱层析技术测定细菌培养液中短链脂肪酸的种类及相对含量。
思考题： 刚果红负性染色有何优点？菌斑采集时应该注意什么？
第一节 口腔微生物学实验
实验二 变异链球菌的分离和鉴定
实验目的和要求： 通过对菌落特点和菌细胞形态及革兰染色特征的观察，初步掌握菌斑标本中变异链球菌 的分离、培养和表型鉴定的主要程序和方法，熟悉牙菌斑中常见细菌的菌落特点、菌 细胞形态及革兰染色特点。
实验主要设备、器材等： 色谱仪，细菌培养箱，离心机，PH计，三角烧瓶，接种环，移液 器，微量注射器和 EP管等。
第一节 口腔微生物学实验
实验方法：
样品制备：
将纯化菌落加入 10ml的BHI培养 基中培养48小时
用磷酸条pH 值至1.7
取上清1.0ml，加 乙醚0.5ml，振荡、 离心
取上清液 20μl进样分 析
实验原理： 糖在强酸溶液中加热，脱水生成羟醛，再变成呋喃衍生物。此衍生 物可以与各种试剂 反应生成有色物质，然后用分光光度计测得密度值，进而计算出糖的含量。以蒽酮 法为例,其可与单糖、双糖、糊精和淀粉反应生成有色 化合物，在一定的浓度范围内， 测得的葡聚糖含量与光密度值成正比。
做生化实验，可将其放置在4℃冰箱内，时间最好不超过96小时。 预成酶微量生化实验所用细菌应来自不加血的非选择培养基，以避免产生 假阳
性结果。
实验报告： 变异链球菌的分离与鉴定。
思考题： 变异链球菌的菌细胞形态特征、菌落特征、耐氧特征和生化反应特征主要有哪些？
第一节 口腔微生物学实验
实验三 细菌代谢酸的测定
杆菌； 梭状菌：菌细胞直径0.3μm～1.0μm，长约10μm，其末端呈梭状； 弯曲杆菌：菌细胞呈新月形或弯曲状； 螺旋体：菌细胞宽0.2μm～0.5μm，长约10μm～20μm，螺旋形，包括大、中、小三种
螺旋体。
第一节 口腔微生物学实验
实验结果与分析：
龈上菌斑涂片刚果 红负性染色结果
注意事项： 1.染色操作中，用浓盐酸熏蒸涂片时要小心。 2.该法不能检测细菌的活动性，但染色涂片可长期保存。
色谱层析：
开机，依次用甲醇、三 蒸水冲洗分析柱20～ 30分钟，流动相平衡 至基线平稳
吸取20µl混合标准酸进 行色谱分析，记录各 组分的保留时间和峰 面积
同法对20µl细菌培养上清 液的乙醚提取物进行分析， 记录各组分的保留时间和 峰面积
第一节 口腔微生物学实验
实验结果分析： 结果计算： 培养液中各组分保留时间与标准酸图谱比较定性，按下式计算： C有机酸 = Area有机酸 Area标准×C标准
在5%～10%CO2、90%～95%的N2，或80% N2、 10%CO2和10%H2的大气环境下37℃孵育48小时
第一节 口腔微生物学实验
实验结果及结果评价 表型鉴定——（2）菌细胞形态和染色特征观察 菌细胞形态：球形、杆形、球杆形、弯曲状、梭状、菌细胞末端形状、细胞 内有无颗粒、肿胀等。 革兰染色特征：阳性、阴性染色,染色均匀性。
第一节 口腔微生物学实验
实验结果及结果评价
生化鉴定：
革兰染色鉴定次代培 养为纯培养后，收集 琼脂表面的菌苔，用 PBS稀释成2×109/ml 菌量
取出反应板，加入 指示剂，观察记录 结果
甘露 山梨 菊
醇
醇
糖
取待测的细菌悬 液100μl，加入 10个反应板微孔 中
振摇混合30秒后， 37 ℃孵育4小时-24 小时
实验原理： 变异链球菌能发酵蔗糖等多种碳水化合物，而其他口腔链球菌不发酵山梨醇和甘露醇； 根据其菌落形态、染色特点及耐氧情况，以其特殊的生化反应可以分离和鉴定变异链 球菌。
实验内容：
菌斑标 本的采 集
处 理 转 送
第二节 口腔生物化学实验
接种 和培 养
细菌
观 察
表型 鉴定
次代 培养
生化 鉴定
主要实验设备和器材、试剂等： 厌氧培养装置如简易厌氧袋、厌氧罐、厌氧培养箱或厌氧手套箱均可；普通孵箱，旋涡混
浅黄色+、紫蓝色碳粒沉于管底+， 碳粒和明胶混合褐色絮状沉淀+，无沉淀或 沉淀易溶解-
黑色+、不变色-
反应板微量快速生化实验： 利用细菌产生的预成酶（胞外酶），在37℃普通孵箱中与生化试剂基质产生特异的酶反 应，通过各种指示剂或特殊的显色产物即可在4小时～24小时观察到结果。反应板微量快 速生化实验的生化鉴定系统包括30个生化实验基质与相关指示剂、磷酸盐缓冲液 （PBS）、细菌标准浊度管以及8个鉴定系列,可根据细菌的形态、染色性及耐氧实验结果 选择不同的系列生化基质进行鉴定。这8个鉴定系列是：
产生吲哚(IND) 色氨酸基质液
还原硝酸盐(NAT) 硝酸盐基质液
产生脲酶
尿素酚红液
产生β-半乳糖苷 酶(ONPG)
ONPG基质液
水解精氨酸 精氨酸基质液
(APH)
Zhrlich试剂 A液：5%α-奈胺溶液 B液：0.8%对氨基苯磺酸盐
/
/
Nessle试剂
水解七叶苷
七叶苷基质液
/
(ESC)
可溶性淀粉培养
菌种鉴定——变异链球菌群细菌的鉴别：
特性
需氧生长 来源
生物变型 血清变型 产生H2O2 V-P试验 水解
精氨酸 七叶苷 发酵 甘露醇 山梨醇 蜜二糖 棉子糖 抗杆菌肽 DNA的G+C摩尔分数 %
变异链球 菌
生长差 人 Ⅰ
c，e，f +
+
+ + + + + 36～38
大鼠链球 菌
生长差 大鼠、人
Ⅱ b +
合器，微量振荡器，和普通光学显微镜。 可调式移液器、加样头，小试管，三角形推棒，接种环、酒精灯，载玻片，无菌棉签，96
孔反应板，EP管；口腔检查用口镜，镊子，检查盘，无菌纱球，无菌探针和龈上锄形洁治 器。 革兰染色试剂，系列生化基质和指示剂（包括甘露醇、山梨醇、菊糖、精氨酸试剂、七叶 苷水解试剂）。 变异链球菌ATCC25175悬液。 MS琼脂、BHI琼脂培养基、巯基乙醇酸盐转送液，0.2mol/L、pH 7.0～ 的无菌磷酸盐缓 冲液(PBS)等。
第一节 口腔微生物学实验
实验方法：变异链球菌群细菌的分离和表型鉴定 菌斑标本 置转送液中运 分散、稀释 送
接种到MS或TS琼脂上 微氧孵育（37℃、5%～10% CO2 48小时）或厌氧孵育（37℃48小 时、90%N2+ 10%CO2或 80%N2+10%CO2+10%H2）
菌落、菌细胞形态检查 次代培养纯化、富集 生化鉴定,确定菌种
水解淀粉(STA)
革兰碘液
基
水解明胶(GEL) 明胶碳粉培养基
/
水解马尿酸盐 (HIP)
马尿酸钠基质液
12%FeCO3试剂
第一节 口腔微生物学硫实代验硫 酸 钠 培 养
产生硫化氢(H2S)
/
结果 红色++、黄色+、绿色红色+、无色红色+、浅黄色红色+、黄色黄色+、无色-
桔黄色+、浅黄色-
黑色+、无色-
要设阳性和阴性对照。 细菌浓度对实验结果的影响 浓度低可导致假阴性结果，最佳的细菌浓度为
2.1×1010/ml～2.4×1010/ml,如菌浓度略低可适当延长酶反应时间。 酶反应时间与菌种的关系 酶反应时间因不同菌种有所差异，以4小时～24 小时
为宜。 待测标本放置时间 以新鲜的放置24小时～48小时培养物为宜。如标本不能 立即
第一节 口腔微生物学实验
革兰染色步骤：
细菌涂片加热固定
加革兰（碱性结晶紫）甲液、乙 液各一滴，混匀后初染30秒
水洗 革兰碘液媒染30秒
水洗 丙酮-乙醇混合脱色 剂脱色5～10秒
水洗 石炭酸复红复染5秒
水洗 干燥后1000倍显微 镜油镜下观察
第一节 口腔微生物学实验
实验结果及结果评价
表型鉴定——（1）菌落特征观察
第一节 口腔微生物学实验
实验方法：
菌斑采 集和处 理
染色
漱口、隔湿→刮取 牙面菌斑
可摘式取菌器或灭菌纸尖吸取龈 沟或牙周袋菌斑
立即置转送液中密 闭 震荡、分散菌斑团块
ห้องสมุดไป่ตู้涂片
革兰负性染色
观察
观察细菌形态
分类
分类
第一节 口腔微生物学实验
①龈沟内采集法
②牙周袋内采集法
龈沟或牙周袋的龈下菌斑采集法
第一节 口腔微生物学实验
精氨 酸试 剂
七叶 苷水 解试 剂
待检 菌阴性对 照阳性对 照
同时加PBS为阴性对照， 加变异链球菌 ATCC25175为阳性对照
分别加入100 μl不同 的生化基质，各加2 孔
第一节 口腔微生物学实验
生化鉴定——反应板微量快速生化实验名称、试剂及结果：
实验（缩写）
基质
指示剂
糖、醇发酵
糖或醇液
BM
第二节 口腔生物化学实验 实验六 龈沟液中碱性磷酸酶活性的测定 实验七 唾液钙和磷含量的测定 实验八 唾液分泌情况的测定
内容目录
第三节 口腔疾病分子生物学 实验九 以釉原蛋白基因进行性别鉴定
第四节 骨组织生物学和口腔细胞培养 实验十 成骨细胞的分离培养 实验十一 成骨细胞的分离培养 实验十二 MTT法检测细胞活性 实验十三 肿瘤细胞迁移实验（细胞划痕法）
刚果红负性染色方法：
载玻片一端滴 一滴2%刚果 红染液
加入待见样 本混合后推 片
置浓盐酸 上熏至变 红色
推片置 显微镜 下观察
Listgarten的分类标准：
球菌：菌细胞直径0.5μm～1.0μm，包括少量球杆菌； 直杆菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长1.0μm～1.9μm，包括部分分支杆菌； 丝状菌：菌细胞宽0.5μm～1.5μm，长与宽之比大于6∶1，菌细胞多为不规则的长丝状
口腔生物学实验教程
提要：口腔生物学实验教程是针对口腔生物学理论课设计的实验指导内容。其教 学目的是让学生通过实验，掌握基本的口腔生物学研究技术和方法，加深对理论 课所学知识的理解，培养学生对口腔医学基础研究的兴趣，了解基本的科研设计 思路，启发学生的科研思维。
内容目录
第一节 口腔微生物学实验 实验一 菌斑的采集、染色和观察、分类 实验二 变异链球菌的分离和鉴定 实验三 细菌代谢酸的测定 实验四 细菌细胞外葡聚糖的测定 实验五 菌斑中pH值的测定
+ +
+ + + + + 41～43
仓鼠链球 菌
生长差 仓鼠、人
Ⅲ a +
表兄链球菌
生长差 人 Ⅳ
d，g + +
野鼠链球 菌
血清型“h”
生长差 生长差
野鼠
猕猴
Ⅴ
ND
e
h
-
-
d
+
-
-
-
-
d
d
+
+
+
+
+
+
+
d
+
-
d
d
ND
+
+
d
-
-
-
+
-
-
42～44 44～46 43～45
ND
第一节 口腔微生物学实验
实验注意事项：
初代培养的菌落观察要点： 形态：如水滴状、圆形、丝状、不规则状、根状、梭形等。 大小：菌落直径一般以mm计，注意大小的一致性。 厚薄：扁平、丘状、凸、半球状、瘤状(中央凸)。 颜色：无色、白、黄、红、绿、黑或棕色。 边缘：如整齐、锯齿状、波状等。 透明度：透明、半透明、不透明。 菌落型：光滑、粗糙、黏液样。 溶血型：α、β、γ（限血平板）。
①革兰阳性厌氧球菌 ②革兰阴性厌氧球菌 ③革兰阳性无芽胞厌氧杆菌 ④革兰阴性无芽胞厌氧杆菌：a.不产黑色素的革兰阴性厌氧短杆菌；
b.产黑色素的革兰阴性厌氧短杆菌；c.革兰阴性厌氧梭状或长杆菌 ⑤革兰阴性弯曲菌 ⑥梭菌属 ⑦变异链球菌和其他口腔链球菌 ⑧微需氧的革兰阴性厌氧杆菌
第一节 口腔微生物学实验