ITC操作流程和测试须知

ITC200操作流程
A．开机、软件、实验前处理
1.开电脑主机、仪器，进行预热。

（注意：通常实验温度为25℃，如果天气温
度高于或低于此温度，首先开空调进行室内温度调节）
2.将实验所用超纯水进行20 min的超声除气泡处理。

3.打开ITC软件“MicroCal ITC200”，三个硬件连接需均为“Success”，联机成
功进入控制界面。

B．清洗仪器
4.取出cell上的塑料盖，将wash tool插入样品池中，用力向下按紧。

5.握住pipette中部将其从清洗位置拔起，放置rest position，将连接头对准连接
孔，随后将金属连接头轻轻拧紧即可（切勿用力拧死，会造成玻璃注射器破碎）。

6.待pipette安装好后将其放回清洗位置（注意轻轻向下按压，确保气密性），
在软件中Instrument Controls下选择Syringe Wash (long)，观察清洗水流是否顺畅，以确保整个ITC仪器各处连接正确。

接下来进行cell wash rinse (long)和syringe wash (long) 2~3次（注意：syringe wash点cancel可省去methanol wash），最后点Cell and Syringe Wash，开始最终清洗以及dyring。

C．样品池上样
7.样品浓度：如果已知K D值，可根据公式（C=样品池样品浓度/K D*N，C值一
般在10-100之间实验结果最好）估算，或参照下图数据。

如果不清楚KD，可按经验浓度范围进行准备，样品池一般为10 uM~10 mM，滴定针比样品池浓度高10~50倍，超声脱气10 min。

8.取出wash tool。

用玻璃注射器将样品池中wash残液吸出，至少进行一次样
品池的润洗。

玻璃注射器吸取约350 μL样品，轻弹赶出气泡，注射器对准样品池孔慢慢插入，轻触底部后抬起1mm，稳住针筒，缓慢推入样品至溢出池孔，将注射器取出时，要保证样品池池口外还能看到溶液，将注射器卡在样品池池口，把池口外的溶液吸干；以同样方法在参照池内加入水。

D．滴定针上样
9.将装有约60~100 μl样品的试管放入样品试管槽，将试管盖子卡在右侧的缺口
位置；在软件中Instrument Control下选择Syringe Fill，按照软件提示将pipette
置于rest position，按照软件提示将pipette置于上样位置，点击OK。

滴定针不要压到试管底部，要稍微留点空间。

10.根据软件提示，检查样品池和对照池是否加满，根据软件提示将连接头旋出，
放回原位置，拧紧固定。

根据软件提示将pipette插入样品池中，点击OK（注意轻轻向下按压，确保气密性）。

（实验关键：两个样品所用缓冲液尽可能完全一致，尽可能避免使用有机溶剂。

）
E．参数设置
11.参照下图
12.结果保存设置：Data File Path and Setup File Path。

F．实验进行中
13.点击Start，开始运行程序。

G．实验后处理
14.实验完毕，清洗仪器，重复步骤5~6，最后将wash tool和连接头归于原位。

15.关闭软件、仪器，填写实验记录，进行实验数据分析，关电脑以及总电源。

ITC测试须知
1.样品体积（一次实验所需）：注射器（分子量较小的物质，例如：DNA、金
属离子、多肽等）为60μL，样品池（分子量较大的物质，例如：蛋白、络合剂等）为400μL。

2.样品浓度：注射器内物质的浓度是样品池中的10~20倍（若是浓度太高，形
成曲线会非常陡）；浓度尽可能确切，否则计算的常熟值会不准确；样品池的浓度和所要测KD（亲和力）值相关，一般是KD值的10~40倍（不同实验需摸索条件）
3.（重要）样品池和注射器中的样品缓冲液成分要尽可能完全相同，包括成分
和pH值：pH值相差不超过0.05pH单位。

最好是两种溶液在同样的buffer 中充分透析以达到完全的化学平衡。

4.尽量不要使用还原剂，如果必须使用，用TCEP和β-巯基乙醇，不要使用DTT。