（特种经济动物饲养专业论文）家蚕丝腺高丰度表达基因Bmtdh和Bmsps1的克..

第４章家蚕Ｂｍｔｄｈ基因的克隆和序列分析
４．１Ｂｍｔｄｈ基因的电子克隆
以家猪（ｓｓｃｒｏｆａ）苏氨酸脱氢酶基因的氨基酸序列作为质询序列，用ＴＢＬＡＳ‘ｒＮ程序检索ＮＣＢＩ的家蚕ＥＳＴ库进行电子延伸，最终得到一条长１２４６ｎｔ的重叠群（ｃｏｎｔｉｇ），该重叠群由２１条家蚕同源ＥＳＴ（Ｅ＜＝ｌｅ一３０）拼接而成，包含一个长１０２６ｎｔ的完整ＯＲＦ，见图４－１。

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图４—１Ｂｍｔｄｈ基囡的２１条同源ＥＳＴ应用ＳｅｑＭａｎ软件的拼接结果
４．２Ｂｍｔｄｈ基因的ＲＴ－ＰＣＲ扩增和克隆
以家蚕５龄３天丝腺ｃＤＮＡ为模板，以Ｂｍｔｄｈ＿Ｆ／Ｂｍｔｄｈ＿Ｒ引物组合，进行ＲＴ－ＰＣＲ。

产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，出现一条约ｌｋｂ的特异条带（见图４—２），与预期的片段大小相符。

：恃该片段纯化回收，连接到ｐＭＤＴ．１８载体中．筛选阳性克隆。

将筛选出的阳性克隆测序，并与电予克隆获得的基因序列进行比较，结果表明两者完全一致，由此我们得到了Ｂｍｔｄｈ基因的１０２６ｂｐ的完整ＯＲＦ序列。

图４－２Ｂｍｔｄｈ基因ＯＲＦ的ＰＣＲ扩增
１－－Ｂｍｔｄｈ—Ｆ／Ｂｍｔｄｈ—Ｒ引物，卧５龄３天丝腺ｅＤＮＡ
为模板ＰｅＲ产物电泳结果
Ｍ—ＤＬ２０００
ｍａｒｋｅｒ
西南大学硕ｋ学位论文
４。

３Ｂｍｔｄｈ基因５＂－Ｕ’ＦＲ序列的克隆
为了得到Ｂｍｔｄｈ基因的完整ｅＤＮＡ序列，我们竞隆了该基闪的５、一１Ｊ‘１１Ｒ。

以
Ｂｔｄｈ５ｕｔｒ—Ｆ１／ＲＩ、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒ＿Ｆ２／Ｒ１、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒ＿Ｆ３／Ｒ１、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒ—Ｆ４／Ｒ１、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒ＿Ｆｌ／Ｒ２利Ｂｔｄｈ５ｔａｔｒ—Ｆ２／Ｒ２批６对引物组合，分别以大造基因维ＤＮＡ作为模扳进行ＰＣＲ。

结果前４列
引物的ＰＣＲ产物均出现了单一条带，而后２对引物（Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ１／Ｒ２和Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ２／Ｒ２）引
物纲台无特异条带出现，见图４．３ａ。

以Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ１／Ｒ２、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ２／Ｒ２、Ｂｔｄｈ５ｕｌｒＦ３／Ｒ２、
Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ４／Ｒ２、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦＩ／Ｒｌ、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ２／Ｒ１和Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ３／ＲＩ共７刘引物组合，分别
以５龄３天丝脉ｅＤＮＡ作为模板进行ＰＣＲ，只有Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦｌ／Ｒ２组合的产物出现了单一条带（图４—３ｂ）。

图４－３Ｂｍｔｄｈ５－ｕ１Ｒ序列的ＰＣＲ扩增与克隆
Ｍ。

Ｉ）１．２０００ｍａｒｋｅｒ；（ａ１为大造基因组ＤＮＡ模版ＰＣＲ结果．１一一６引物组合分别是
Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ１／Ｒ１、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒ＿Ｆ２／Ｒ１、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＩＦ３／ＲＩ、ＢｔｄｈＳｕｔｒ＿Ｆ４／Ｒ１、ＢｔｄｈＳｕｔｒ＿Ｆ１／Ｒ２、
ＢｔｄｈＳｕｔｒＦ２／Ｒ２；（ｂ）为５龄３天丝腺ｅＤＮＡ模版ＰＣＲ结果．１～７引物组台分别是
Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ１／Ｒ２、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ２厂Ｒ２、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ３／Ｒ２、Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ４瓜２、ＢｔｄｈＳｕｔｒＦ１／Ｒ１、
Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦ２／Ｒｌ和ＢｔｄｈＳｕｔｒＦ３／ＲＩ：㈦为Ｂｔｄｈ５ｕｔｒＦＩ／Ｒ２；ｌ物组台，５龄３天丝隙ｃＤＮＡ模
板ＰＣＲ，目的条带纯化回收检测。

匣ｌ收特异片段，连接到ｐＭＤＴ一１８载体中并测序，获得了长度为２２７ｂｐ的５＂－Ｕ’ＦＲ序列（ｉ．＇ｘｌ４－３ｃ），其３、．端的序列与电子延伸得到的ｔ２４６ｎｔ的曩叠群５’端序列一致。

由此我们获得了Ｋ１３１０ｂｐ的Ｂｍｔｄｈ基因的ｃＤＮＡ序列（登录号：ＡＢＡ４３６３９１），见恻４－４。

Ｂｔｄｈ５ｕｔｌＦ１
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两南大学硕士学位论文
图４－１１Ｂｍｔｄｈ基因５ｔｈ一３－ｄａｙ不同组织ＲＴ－ＰＣＲ
１－中场，２－血液，３．脂肪体，４－卵巢，５－丝腺，６－马氏管
Ｍ—ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，ａｅｔｉｎ３－ａｏｔｉｎ３基因作为内参。

抽提５龄３天家蚕不同组织的总ＲＮＡ，以Ｂｔｄｈ＿Ｆ／Ｂｔｄｈ—Ｒ引物组合，进行ＲｑｚＰＣＲ。

反应产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测，结果在丝腺和卵巢组织中扩增出了明亮的目的条带，中肠、血液和脂肪体３个组织中只有微弱的目的条带出现，在马氏管中根本没有目的条带出现。

这与ＥＳＴ数据的分析结果基本相符，进一步证明Ｂｍｔｄｈ基因在家蚕的丝腺和卵巢中的表达丰度较高，在其他的一些组织中的表达量很低或者不表达。

４．６，３Ｂｍｔｄｈ基因在不同发育时期的转录分析
图４．１２Ｂｍｔｄｈ基困不同发育时期ＲＴ－ＰＣＲ
１ｔ１１分别为：Ｇ２胚胎、Ｉｓｔ．Ｄａｙ２、１４＿Ｍ、２“ｃ１．Ｄ２）、
２“．Ｍ、３＂ＬＤ２、３ｒｄ．Ｍ、４ｔｈ．Ｄ２、４ｔｈＭ、５“．Ｄｌ、５“一Ｄ３：
Ｍ－ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ：ａ３．ａｃｔｉｎ３基因内参。

抽提家蚕卵（Ｇ２胚胎）、１～３龄幼虫的总ＲＮＡ和４龄、５龄不同发育时期的丝腺总ＲＮＡ，以ＢｔｄｈＦ／ＢｔｄｈＲ引物组合进行ＲＴ－ＰＣＲ，分析不同发育时期Ｂｍｔｄｈ基因转录水平。

结果显示，在４龄眠期（４ｔｈ＿Ｍ）、５龄１天（５ｔｈ＿Ｄ１）和５龄３天（５ｔｈ＿Ｄ３）三个发育时期的丝腺组织中扩增出了明亮的目的条带，在Ｇ：胚胎、１龄２天（１５ｔ－Ｄａｙ２）和４龄２天（４“－Ｄ２）三个发育时期的总ＲＮＡ中却未能扩增出目的条带，其他的几个发育时期虽扩增出了目的条带，但亮度较弱。

这说明，４龄眠期、５龄１天和５龄３天三个发育时期的Ｂｍｔｄｈ基因在丝腺组织的转录水平很高，而在此之前Ｂｍｔｄｈ基因的转录一直处于较低的水平；Ｇ：胚胎、１龄２天和４龄２天三个发育时期没能检测到Ｂｍｔｄｈ基因的转录，则进一步说明，在家蚕幼虫发育的早期，Ｂｍｔｄｈ基因的表达水平很低或者根本就不表达。

这一特点与家蚕幼虫发育后期尤其是５龄期，加速合成蚕丝蛋白为吐丝结茧做准备的生理活动相一致。

由此我们推测Ｂｍｔｄｈ基因很可能参与了蚕丝蛋白的合成过程。

瘃蚕１７ｒａｓｐｓｌ基因的克隆与原核表达分析
ＢｍｓｐＦＩ基因起始密码子卜游２５６ｂｐ的５＂－非翻译区（５、一Ｕ７ＦＲ）ｔ见圈５－３。

图５－２ＢｍｓｐｓＩ基因ＯＲＦ的ＰＣＲ扩增Ｉ．Ｂｍｓｐｓｌ．ＦＩＲ引物组台．以５“－Ｄ３丝腺ｃＤＮＡ模扳ＰＣＲ．Ｍ—ＤＬ２０００ｍａｒｋｃｒ。

圉５－３Ｂｍｓｐｓｌ基因５＂－Ｕ１１Ｒ的ＰＣＲ扩增
ｌ—ＢＳＳｕｔｒＦｌ／ＢＳＳｕｔｒ＿Ｒ引物组台，以５”·Ｄ３
丝腺ｅＤＮＡ模板ＰＣＲ，Ｍ—ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ。

由此，我们得到了长１８１７ｂｐ的Ｂｍａｐｓｌ基因ｃＤＮＡ序列（登录号：ＡＢＡ４３６３９．１），其中包含长１２０９ｂｐ的完整ＯＲＦ序列，如图５－４。

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４
家蚕Ｊ５＇ｍｓｐｓｌ基因的克隆与燎核表达分析
图５－５Ｂｍｓｐｓｌ基因结构简图
黑色方框表示ＯＲＦ，粗黑线分别代表５＂－ＵＴＲ和３＂－ＵＴＲ序列，虚线代表ｐｏｌｙＡ
尾巴。

ＡＡＴＡＡＡ为可能鹊ｐｏｌｙＡ信号位点。

用ＢｍｓｐｓｌＦ／Ｒ为引物，以大造基因组ＤＮＡ和５龄３天丝腺ｃＤＮＡ分别作为模板进行ＰＣＲ，结果２模板的扩增出了同样大小的目的片段，这也进。

一步印证了Ｂｍｓｐｓｌ基因没有内含子筋存在，见酬５－６。

图５－６Ｂｍｓｐｓｌ基因结构分析
Ｉ－Ｂｍｓｐｓｌ』／Ｒ引物组合，大造基因组ＤＮＡ模板
２·Ｂｍｓｐｓｌ＿Ｆ／Ｒ引物，５’ｈ＿Ｄ３丝腺ｅＤＮＡ模板
Ｍ－ＤＬ２０００ｍａｒｋｅｒ
５．５Ｂｍｓｐｓｌ基因保守功能域和系统进化分析
对包括家蚕在内的３２个物种的ＳＰＳＩ酶的氨基酸序列．应用ＣＬＵＳＴＡＬＸ软件，以１０００次重复随机抽样。

构建邻位对接系统进化树。

结果表明，３２个物种在总体上分成３大类群：
细菌，古细菌，和真核生物。

在真核生物形成的大群中，昆虫和脊椎动物分别独立聚类成为２个Ⅺ明￥．而原生动物没能聚类在一起，显得比较分散。

目前的研究证实，细菌只有ＳＰＳＩ酶．古细菌只有ＳＰＳ２酶，而昆虫和脊椎动物同时拥有这２个酶．说明硒磷酸合成酶的进化方向并不唯一。

由此我们推测，系统进化树上原生动物之间较为分散的聚类，恰好说明了硒元素在经由硒磷酸合成酶代谢途径的进化历程上，原生动物作为过渡阶段的特点；比较分散的聚类，或许正是原核生物在进化选择上的不唯一性所造成的。

酿酒酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）和生殖道支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｇｅｎｉｔａｌｉｕｍ）缺少的硒磷酸合成酶同源蛋白的事实从另一方藤也部分支持了这种推测。

比较人、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫和大肠杆菌５个物种ＳＰＳｌ酶的氨基酸序列，结果发现，真核生物之闻的序列保守性非常高，其中家蚕与果蝇的周源性为９４％，与人的同源性为８６％，与线虫的同源性为６６％。

而家蚕ＳＰＳｌ酶与大肠杆菌的同源性很低，仅为４２％。

但真核生物和原核生物的ＳＰＳｌ酶所行使的生理功能是相同的，都是催化硒化物和ＡＴＰ合成单硒磷酸盐，为硒蛋白的合成提供硒元素供体。

由此推测真核生物和原核生物的ＳＰＳｌ酶在氨基酸序列上的同源性虽低，但它们的三级结构可能比较相似。

从而保证了他们拥有相同的生
４３
西南大学硕士学位论文
理活性。

图５－７，２个物种ＳＰＳＩ酶氪基酸序列的系统进化树
Ｉ，细菌：１１，古细菌；ｌＩＩ，原生动物；ＩＶ，脊椎动物：Ｖ，昆虫。

在ＮＣＢＩ网站检索Ｂｍｓｐｓｌ基因推导氨基酸序列的蛋白质保守域，结果显示家蚕Ｂｍｓｐｓｌ基因包含了两个典型的功能域ＳｅｌＤ＿Ｎ（Ｌｅｕ４５一Ｐｒ０２０８，Ｅ＝４ｅ一４９）和ＡＩＲＳＣ（Ｇｌｙ２２０－Ａｓｐ３９１
Ｅ＝Ｓｅ．１０），具有完整的ＳＰＳ酶的结构特征，属于ＡＩＲ合酶家族（ＡＩＲＳｙｎｔｈａｓｅｓｆａｍｉｌｙ）。

ＳＰＳ酶Ｎ末端（ＳｅｌＤＮ）是典型的ＡＴＰ结合结构域，功能在于结合ＡＴＰ台成单硒磷酸，为生物提供硒元素供体。

ＡＩＲＳｃ是Ａ１Ｒ合酶相关蛋白的Ｃ端结构域，是硒化物水解酶的特征结构域。

由此可见，家蚕Ｂｍｓｐｓｌ基因具有典型的硒磷酸合成酶特征，催化了家蚕体内硒化物利。