鼻咽癌 Genistein对鼻咽癌细胞增殖抑制作用的研究_阿依恒_曲库尔汗

Genistein对鼻咽癌细胞增殖抑制作用的研究阿依恒曲库尔汗1*,阿孜古丽吐尔逊2,卢晓梅2,刘立中1**(新疆医科大学第一附属医院1耳鼻咽喉科,2中心实验室细胞生物学研究室,新疆　乌鲁木齐　830054)摘要:目的:探讨酪氨酸蛋白激酶(T PK)抑制剂G enistein对鼻咽癌细胞增殖的抑制作用。

方法:以不同浓度的Genistein作用于鼻咽癌细胞,采用M T T法检测细胞的增殖程度,倒置显微镜下观察肿瘤细胞的形态学变化。

结果:Genistein引起鼻咽癌细胞增殖比明显下降,其程度随Genistein浓度增高而增强;Ge nistein促进鼻咽癌细胞形态发生改变并导致细胞死亡。

结论:G enistein对鼻咽癌细胞的增殖有抑制作用,并破坏肿瘤细胞的结构而使其死亡。

关键词:Ge nistein;鼻咽肿瘤;增殖;抑制中图分类号:R979.1;R739.6 文献标识码:A 文章编号:1009-5551(2007)03-0248-03Inhibition of Genistein on proliferation of CNE cells in nasopharyngeal cancerAyhen Xukurhan,Aziguil Tuersun,LU Xiao-mei,et al(Department of Otorhinolary ngology,F irst Aff iliated H ospital,X injiang Medical University,Urum qi830054,China)A bstract:Objective:To investig ate the inhibition of Genistein on the proliferation of naso pharyngeal cancer cells.Methods:Cultured CN E cells w ere stim ulated w ith different do ses o f Genistein.The prolife ration of CN E cells were de termined by M T T,the mo rphological changes o f tumo r cell w ere observed under invert-ed microscope respectively.Results:Proliferatio n ra tio of CNE cells w as significantly decreased by Gein-stein in dose dependent manner and it promo ted cancer cellular fo rm changes as w ell as causesed the cell death.Conclusion:Genistein could inhibit the pro liferatio n and destroy the tumo r cell shape and cause death.Key words:Genistein;nasophary ngeal neoplasm;pro liferatio n;inhibition Genistein是来源于豆类植物的一种强的酪氨酸蛋白激酶(tyro sine pro tein kinase,TPK)抑制剂,与多种肿瘤发生的低风险有关[1],并对多种肿瘤的增殖有抑制作用[2]。

鼻咽癌是头颈部肿瘤中最常见的恶性肿瘤,其病因和发病机制目前尚不十分清楚,不易早期发现,放疗为其最主要的治疗方法,但副作用大,疗效不甚满意。

本研究以鼻咽癌CNE 细胞株为研究对象,以不同浓度的Genistein作用于CN E细胞株,观察Genistein对CNE细胞增殖的抑制作用及细胞形态的变化,并探讨其作用机制,为鼻咽癌的生物治疗提供新的尝试。

1　材料与方法1.1　细胞系　鼻咽癌CNE细胞株购于上海中科院细胞所。

1.2　药品及试剂　Genistein、二甲偶氮唑蓝(M TT)和碘化丙啶(PI)为Sigma公司产品, DM EM培养基为Gibco公司产品,小牛血清(NBS)为杭州四季青产品,DMSO(二甲基亚砜)购自Sig-ma公司,其他试剂均为分析纯,顺铂为市售,胰蛋白酶为Sig ma公司产品。

1.3　实验方法1.3.1　细胞培养　将复苏的CN E细胞用含10%248新疆医科大学学报　JO U RNA L OF XIN JI AN G M EDICA L U N IV ERSIT Y　2007M ar.,30(3)* **作者简介:阿依恒曲库尔汗(1969-),男(哈萨克族),硕士,主治医师,讲师,研究方向:头颈部肿瘤。

通讯作者:刘立中(1956-),女,博士,主任医师,教授,研究方向:头颈部肿瘤,E-m ail:liu l izhongno.1@。

小牛血清的DM EM培养基,在37℃,5%CO2饱和100%湿度的孵箱中培养,95%空气,每24小时换液1次。

1.3.2　细胞增殖程度检测　采用M T T法检测细胞增殖程度,将培养的CNE细胞随机分为对照组与实验组。

细胞达到亚融合状态时,常规制成单细胞悬液,以5000个/孔将细胞接种于96孔板,每组3个平行孔。

培养24h后,4℃冰箱放置24h,使细胞同步化。

弃去培养液,每孔按分组要求分别加入Geinstein(100μg/ml)、顺铂(阳性对照)、DM EM (阴性对照)及DM SO培养液,使各孔的终体积均为200μl,Geinstein组1、2、3、4的终浓度分别为25、50、100、200μg/ml。

在37℃、5%CO2环境中培养48h后弃去培养液,各孔加入M TT20μl(5m g/ ml),37℃孵箱4h;各孔加入二甲基亚砜150μl,避光振荡10min,酶标仪640nm波长测定各孔吸光值,以增殖比表示增殖程度:增殖比(%)=实验组吸光值/对照组吸光值×100。

1.3.3　细胞形态观察　倒置显微镜下动态观察细胞生长状况,分别于干预24、48、72h观察细胞并拍照。

1.4　统计学处理　应用SPSS11.5软件包进行数据统计分析,实验数据以x±s表示,采用t检验,检验水准α=0.05。

2　结果2.1　细胞增殖程度　Genistein对CNE细胞的增殖有明显抑制作用。

加入Genistein后,与对照组相比, Genistein组细胞增殖比明显下降,其下降程度随Genistein浓度增高而加大,高浓度最为明显(表1)。

表1　Genistein对CNE细胞增殖的影响(x±s)分组Genistein浓度(μg/ml)增殖比(%)空白对照组0100阳性对照组-31.58±0.03阴性对照组0150±0.16 Genistein组12573.68±0.03* Genistein组25084.21±0.22* Genistein组310078.95±0.08* Genistein组420039.47±0.02** 注:与空白、阴性对照组比较,*P<0.05,**P<0.012.2　细胞形态观察结果　倒置显微镜下可见阴性对照组(DMEM)和空白对照组(DMSO)肿瘤细胞呈上皮型贴壁生长,细胞轮廓清楚,细胞间结构紧密,细胞生长旺盛,24h细胞约占空底面积的40%～50%,48h约占70%～80%,72h约占85%～90%,说明肿瘤细胞接种量适宜。

受试物低浓度到高浓度作用后,失去原有肿瘤细胞形态,细胞逐渐变为圆形,体积缩小,细胞间接触变松,折光性及贴壁能力减弱,增殖减慢。

细胞膜上出现小泡及胞膜皱缩,胞浆变少,胞核明显固缩,核颜色加深,折光性加强,染色质凝集成块状,部分细胞裂解为碎片状漂浮。

浓度愈高,细胞改变愈明显,其抑制作用呈药物浓度-时间依赖性;阳性对照组作用更明显,24h开始出现细胞裂解现象,空白对照组、阴性对照组细胞则出现贴壁生长,胞浆饱满,融合成片,无核固缩现象,无明显变化。

Genistein组(200μg/ml)作用后细胞形态变化见图1。

3　讨论Genistein是一种广谱的蛋白酪氨酸激酶抑制剂,研究发现它对肿瘤细胞内由于细胞-细胞外基质的粘附以及相互作用引起的蛋白酪氨酸磷酸化有明显的抑制作用,并可能干扰细胞外基质信号的转导,影响细胞侵袭的起始,进一步影响侵袭相关性质,如细胞运动、基质蛋白酶活性等[3]。

在细胞水平,Genistein可诱导癌细胞的凋亡和分化,抑制细胞增殖,使细胞周期进展停滞;在器官水平,抑制血管形成[4]。

而且,Genistein兼具弱雌激素作用和抗雌激素作用,是雌激素受体的激动剂,对癌细胞发生发展起关键作用[5]。

Genistein可与ATP竞争TPK上的结合位点,抑制TPK的活性,它还具有抗氧化、凋亡信号传递[6]、抑制拓扑异构酶等多种生物学功能。

已有研究表明,在Genistein高摄入和高血浆水平的人群中,前列腺癌的发展受到了限制,提示该化合物可能是一种保护因子。

孙黎光等[7]与卜仁戈等[8]报道,Genistein可以抑制肺癌AG-ZY283A细胞和膀胱癌EJ细胞的增殖。

Genistein 对头颈肿瘤具有化学治疗和化学预防作用[9]。

(下转252页)249新疆医科大学学报　JO U RNA L OF XIN JI AN G M EDICA L U N IV ERSIT Y　2007M ar.,30(3)抗体快速,操作简单,不需特殊设备,可单人份检测,适合急门诊患者和基层医院。

但特异性和灵敏度比TP-ELISA法稍低。

从本试验结果来看,E LISA法和TPPA法的敏感性和特异性都很高。

但TPPA 法操作复杂,试剂昂贵,结果判定难以自动化,限制了其用于大规模标本的筛查[4],而ELISA操作简便,可实现自动化操作,能进行大批量样本检测,由仪器阅读试验结果,使结果更科学、客观、准确。

TP-ELISA与TPPA相关性良好,可作为确证试验[7,8]。

从以上结果可以看出,RPR、金标法明显比ELISA法和TPPA法的敏感性和特异性低,试验假阴性和假阳性较多,在弱阳性标本(S/CO值为1～5)的阳性检出率明显低于S/CO值>5的阳性标本,只能作为辅助试验。

有研究表明,在无梅毒感染史的正常人群阳性率达0.11%[1],如自身免疫性疾病:系统性红斑狼疮、播散性盘状红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血、进行性系统性硬化症、类风湿性关节炎、风湿性心脏病、肝硬化、结节性多动脉炎、干燥综合征、慢性肾炎及海洛因成瘾;少数孕妇,在70岁以上高龄老人中有1%出现假阳性[6,9]。