化学发光免疫分析

化学发光免疫分析
化学发光免疫分析篇一：化学发光免疫分析方法
化学发光是在常温下由化学反应产生的光的发射。

其发光机理是：反应体系中的某些物质分子，如反应物、中间体或者荧光物质吸收了反应释放的能量而由基态跃迁到激发态，当中间体由激发态回到基态时会释放等能级的光子，对光子进行测定而实现定量分析。

化学发光免疫分析方法是将化学发光与免疫反应相结合的产物，因化学发光具有荧光的特异性，但与荧光产生需要激发光不同，化学发光由化学反应产生光强度，并不需要激发光，从而避免了荧光分析中激发光杂散光的影响。

化学发光免疫分析包含了免疫化学反应和化学发光反应两个部分。

免疫分析系统是将化学发光物质或酶标记在抗原或抗体上，经过抗原与抗体特异性反应形成抗原－抗体免疫复合物。

化学发光分析系统是在免疫反应结束后，加入氧化剂或酶的发光底物，化学发光物质经氧化剂的氧化后，形成一个处于激发态的中间体，会发射光子释放能量以回到稳定的基态，发光强度可以利用发光信号测量仪器进行检测。

待测物质浓度因为与发光强度成一定的关系而实现检测目的。

一、化学发光免疫分析方法的类别
化学发光免疫分析法根据标记物的不同可分为3 大类，即化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析和电化学发光免疫分析法。

（一）化学发光免疫分析化学发光免疫分析是用化学发光剂直接标记抗体或抗原的一类免疫测定方法。

目前常见的标记物主要为鲁米诺类和吖啶酯类化学发光剂。

1. 鲁米诺类标记的化学发光免疫分析。

鲁米诺类物质的发光为氧化反应发光。

在碱性溶液中，鲁米诺可被许多氧化剂氧化发光，其中H2O2最为常用。

因发光反应速度较慢，需添加某些酶类或无机催化剂。

酶类主要是辣根过氧化物酶（HRP），无机类包括O3、卤素及Fe3+、Cu2+、Co2+和它们的配合物。

鲁米诺在碱性溶液下可在催化剂作用下，被H2O2等氧化剂氧化成3－氨基邻苯二酸的激发态中间体，当其回到基态时发出光子。

鲁米诺的发光光子产率约为0.01，最大发射波长为425 nm。

2. 吖啶酯类标记的化学发光免疫分析
吖啶酯用于化学发光免疫分析方法（ChemiluminescentImmunoassay，CLIA）由于热稳定性不是很好，Klee 等研究合成了更稳定的吖啶酯衍生物。

在含有H2O2的碱性条件下，吖啶酯类化合物能生成一个有张力的不稳定的二氧乙烷，此二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N－甲基吖
啶酮，当其回到基态时发出一最大波长为430 nm 的光子。

吖啶酯类化合物量子产率很高，可达0.05。

吖啶酯作为标记物用于免疫分析，发光体系简单、快速，不需要加入催化剂，且标记效率高，本底低。

吖啶酯或吖啶磺酰胺类化合物应用于CLIA，通常采用HNO3+H2O2和NaOH 作为发光启动试剂，有些在发光启动试剂中加入Triton X－100，CTAC，Tween－20等表面活性剂以增强发光。

（二）化学发光酶免疫分析
化学发光酶免疫分析（Chemiluminescent Enzyme Immunoassay,CLEIA）是以酶标记生物活性物质进行免疫反应，免疫反应复合物上的酶再作用于发光底物，在信号试剂作用下发光，用发光信号测定仪进行发光测定。

目前常用的标记酶为辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（ALP），它们有各自的发光底物。

HRP 最常用发光底物是鲁米诺及其衍生物。

在CLEIA 中，使用过氧化物酶标记抗体，进行免疫反应后，利用鲁米诺作为发光底物，在过氧化物酶和起动发光试剂（NaOH和H2O2）作用下鲁米诺发光，酶免疫反应物中酶的浓度决定了化学发光的强度。

此传统的化学发光体系（HRP－H2O2－lumi-nol）为几秒内瞬时闪光，存在发光强度低、不易测量等缺点。

后来，在发光系统中加入增强发光剂，以增强发光信号，并在较长时间内保持稳定，便于重复测量，从而提高分析灵敏度和准确性。

碱性磷酸酶（ALP）已广泛用于酶联免疫分析和核酸杂交分析。

碱性磷酸酶和1，2－二氧环己烷构成的发光体系是目前最重要、最灵敏的化学发光体系。

这类体系中具有代表性的是Bronstein 等提出的ALP－AMPPD 发光体系。

AMPPD 为1，
2－二氧环己烷衍生物，它是一种生物化学领域中最新的超灵敏的碱性磷酸酶底物，其特点是反应速度快，在很短时间内提供正确可靠的结果。

在它的分子结构中有两个重要部分，一个是联接苯环和金刚烷的二氧四节环，它可以断裂并发射光子；另一个是磷酸根基团，它维持着整个分子结构的稳定。

（三）电化学发光免疫分析方法电化学发光是指由电化学反应引起的化学发光过程。

Leland［3］等已对三联吡啶钌体系的电化学发光机理进行了深入的研究。

电化学发光的反应在电极表面进行，发光底物为三联吡啶钌［Ru （ b p y）32+］，三丙胺（TPA）用来激发光反应。

在阳极表面，两种物质同时失去电子。

在电极板上Ru （bpy）32+被氧化成Ru （ b p y）33+，TPA也被氧化成阳离子自由基（TPA+ *），TPA+ *自发地释放一个质子而变成非稳定分子（TPA*），将一个电子递给Ru （bpy）33+，形成激发态的Ru （bpy）32+*。

Ru （bpy）32+*在衰减的同时发射一个波长为620 nm 的光子，重新回到基态Ru （bpy）32+。

这一过程在电极表面反复进行，产生高效、稳定的连续发光，并不断增强。

二、化学发光免疫分析方法的应用
自1977 年Halman 等创立化学发光免疫分析方法以来，免疫
化学分析方法在医学检验、食品安全及环境科学方面的应用取得了很大的进展。

（一）医学检测
肺结核病常以人体血清中CA125 含量为疾病标记物，上海交通大学Wang 等建立了CA125 的毛细管化学发光免疫分析方法，以实现对肺结核病的检测。

其方法的线性检测范围为 2.5×10－11～1.0×10－9mol/L，检测限（S/N=3）为1.0×10－12mol/L，且标样的添加回收率为93％～109％。

甲胎蛋白（AFP）为肿瘤疾病标志物，Yang等利用链霉素化毛细管柱，建立了AFP 的化学发光免疫分析方法。

该方法的最低检测限为0.1ng/mL，线性检测范围为0.5～200 ng/mL。

研究结果表明该方法具有结构简单、更好的实用性及较宽的线性范围等优点。

Zhang等［7］利用磁性微粒子和包被小管建立了AFP 的化学发光酶免疫分析方法。

在该方法中，AFP抗体首先包被于两种不同的固相载体上，如磁性微粒子和包被小管。

再分别对这两种包被模式建立的化学发光免疫分析方法进行比较，通过再抗体包被浓度、标记于抗体上HRP 的稀释比例，分析所需时间，化学发光动力学等角度进行衡量，显示磁性微粒子具有较大的优势。

Zhan 等［8］建立了C 反应蛋白的电化学发光免疫分析方法。

首先用生物素标记含有Ru （bpy）32+的脂质体后与亲和素反应，再与生物素化的 C 反应蛋白抗体结合得到抗体包被的脂质体，同时亲和素包被的磁性微粒子与生物素化的抗体反应，得到抗体包被的磁性微粒子。

两种抗体与C 反
应蛋白结合，构成双亲和素桥联的、磁性微粒子为固相分离剂的反应模式。

通过溶解脂质体释放出Ru （bpy）32+测定其强度进行测定。

该方法的最低检测限为100ng/mL，检测范围为100ng/mL～10μg/mL。

Knight 等［9］采用化学发光免疫夹心分析方法对梅毒病毒进行检测，并与传统的分析方法快速血浆素反应（RPR）和酶免疫分析方法（ELISA）进行比较，通过对多种样品进行检测，并与RPR 及ELISA分析方法结果有99.1％的正确率。

茶碱是一种磷酸二酯酶（PDE）抑制剂，用于呼吸系统疾病的治疗。

Zhou等［10］建立了茶碱的化学发光免疫分析方法，该方法的最低检测限为0.51mg/L，线性范围为0.51～40mg/L，板内及板间变异系数分别为3.20％和 3.57％。

通过与FPIA 结果对30 例茶碱浓度进行比较，其相关系数为0.993。

Peter 等［11］通过合成生物素睾酮标记物建立了睾酮的化学发光免疫分析方法，该方法的检测范围为0.2～20.0 nmol/L，最低检测限为0.125 nmol/L，板间方法的精密度为13％～16％，通过质谱仪器确证其方法的回收率为95％，显示了方法良好的灵敏度和准确率。

Mirasoli等［12］建立了唾液中皮质醇的固相竞争化学免疫分析方法。

通过人工重组的发光蛋白标记皮质醇而建立的免
疫分析方法检测限为3nmol/L，线性检测范围为10～1 000 nmol/L。

其他关于这方面报道还有Perschel 等［13］通过化学发光免疫分析对原发性醛固酮过多症（PHA）进行快速筛选，
Tudorache等［14］利用磁颗粒免疫支持液膜方法（m-ISLMA）检测唾液中的孕酮含量，Iwata 等［15］利用双夹心化学发光免疫分析方法测定血浆中内皮素－1的含量等。

关于这方面的应用，化学发光免疫分析方法应用的最为广泛，正是在医学检测方面大量成功的应用，带动了化学发光免疫分析方法在其他学科方面的普及。

（二）食品安全检测
Quan 等［16］建立了食品中伏马菌素B1 的化学发光酶免疫分析方法，经方法优化后其线性检测范围为0.14～0.9μg/L，方法的灵敏度（IC50）为0.32 μg/L，方法的最低检测限（IC10）为0.09 μg/L，与伏马菌素B1 的ELISA 方法相比，其方法灵敏度提高了10 倍。

且通过样品的添加回收率试验表明其有良好的回收率，其分析结果与ELISA 分析方法与HPLC 方法有良好的相关性。

Yang等［17］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B（SEB）的碳纳米管的化学发光免疫分析方法，通过将SEB 抗体吸附在碳纳米管表面，然后将抗体－碳纳米管固定在聚碳酸酯表面，再通过增强化学发光免疫法测定SEB 含量。

牛奶、苹果汁和婴儿食品中的SEB 最低检测限为0.01 ng/mL，而ELISA 的最低检测限为 1 ng/mL。

Lin 等［18］人建立了食品中氯霉素的化学发光免疫分析方法，其方法灵敏度（0.05 ng/mL）、精密度、特异性及准确度等指标均与ELISA 分析方法类似。

10个样品的板内和板间变异系数分别小于8％和20％，且样品的添加回收率在87％～100％。

四川大学华西医学院杨秀岑等人［19］建立了食品中沙门氏菌的化学发光免疫分析方法。

该方法选用聚氯乙烯平片作为载体固定细菌，再与一抗及HRP 标记二抗温育，以化学发光免疫法测定食品中沙门氏菌。

利用该方法对62 份食品样品进行检测，以P/N≥3作为阳性标准，符合率为85.5％。

Magliulo 等［20］建立了牛奶中黄曲霉毒素M1的化学发光酶免疫分析方法，通过将黄曲霉毒素M牛血清白蛋白包被在聚丙烯板上，通过酶标二抗在含有鲁米诺的基板上进行检测。

该方法的最低检测限为1 pg/mL，且板间板内数据的变异系数均低于9％，回收率在96％～122％之间。

Lin 等［21］建立了农产品中黄曲霉毒素B1 的化学发光免疫分析方法。

该方法线性检测范围在0.05～10 ng/g 之间，检测灵敏度为0.01 ng/g，板间及板内变异系数分别为12.2％及10.0％。

农产品中样品添加回收率在79.8％～115.4％之间。

同时，将建立的分析方法与黄曲霉毒素商品化酶联免疫试剂盒进行了相关性试验，相关系数为0.9098，显示其有较好的应用前景。

Alexandra 等［22］通过酶联免疫法和化学发光酶免疫法建立了DDT 及其代谢物的免疫分析方法，并对食物及环境样品中的DDT 及其代谢物进行检测。

对DDT 及其代谢物，酶联免疫法的IC50值为0.6 ng/mL，而化学发光酶免疫法的IC50值为0.2ng/mL。

David等［23］通过流动注射化学发光检测法对水样中的阿特拉津进行检测，对水样的最低检测限为 1.3 ng/mL，检测线性范围为2.15～150 ng/mL，通过SPE 柱净化浓缩后，对水样的最低检测
限为14 ng/L。

Samsonova等人［24］利用化学发光免疫分析方法建立了3 种三氮苯类除草剂（阿特拉津、草净津和莠灭净）的多残留免疫分析方法。

在用建立的方法对含3 种除草剂混合物的环境样品进行检测，检出正确率为70％～100％。

Waseem等人［25］通过流动注射化学发光免疫分析方法建立了除草剂西草净的检测方法，该方法的线性检测范围为0.01～2μg/mL，最低检测限（S/N=3）为7.5 ng/mL，4条标准曲线各抑制率的相对标准偏差为0.9％～2.3％。

利用建立的方法对水样中的西草净进行检测，回收率在97％～104 ％之间。

中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所Jin 等［26］建立了蔬菜水果中三唑磷农药的化学发光免疫分析方法，该方法的线性检测范围为0.04～5 ng/mL，最低检测限为0.063 ng/mL，对生菜、
胡萝卜、苹果、水和土壤的添加回收率分别为78.71％，67.52％，118.3％，117.2％和122.0％。

同时建立的方法与液质串联质谱法进行相关性实验，结果显示有着较好的相关性（R2= 0.8996）。

Aldo 等［27］建立了牛尿样品中瘦肉精的化学发光免疫分析方法。

该方法以384 孔化学发光黑板为固相载体，样品添加量仅为20 μL。

方法精密度符合分析要求（变异系数小于10％），添加回收率在96 ％～110 ％之间，方法最低检测限为0.08ng/mL。

利用384 孔板为固相载体，可减少80％的试剂用量，并可大大提高对阳性样品的初筛效率。

磺胺－5－甲氧嘧啶是一种兽药，但对人体有害，因此在食品中不得检出。

Wu等［28］建立了牛奶和鸡蛋中磺胺－5－甲氧嘧啶的化学发光免疫分析方法。

该方法的最低检测限为
3.2 pg/mL，线性检测范围为10～2 000 pg/mL 之间，方法变异系数小于18％，样品添加回收率在85％～105％之间。

其他还有如Kijek［28］建立了食品中葡萄球菌肠毒素B 的化学发光免疫分析等相关报道。

（三）环境科学
Christian 等［30］通过化学发光酶免疫分析方法建立了环境内分泌干扰物炔雌醇的免疫分析方法。

其方法的检测限（S/N=3）为0.2±0.1 ng/L，信噪比为10 时其方法的检测限为1.4±0.8 ng/L，并通过建立的分析方法对表面水和污水处理厂的污水中的炔雌醇进行测定。

Pittman等［31］通过磁性小珠和生物素－亲和素为载体建立了水样和土样中2，4，6－三硝基甲苯的免疫夹心电化学发光免疫分析方法。

该方法的最低检测限为0.1±0.8 ng/mL，检测范围为0.1～1 000 pg/mL，其方法灵敏度比文献报道的提高了600 倍。

Zhao 等［32］通过建立微板式磁化学发光酶免疫分析方法来对水样中17β－雌二醇进行检测。

通过微板磁性分离器可避免前处理过程以达到高通量分析，再结合高灵敏度的化学发光体系，建立了该方法。

该方法的检测灵敏度为5.4 pg/mL，检测范围为10～3 000 pg/mL，且板间和板内检测值的变异系数均低于15％。

三、化学发光免疫分析方法的发展趋势
目前，化学发光免疫分析方法的发展主要表现在：（1）常见发光体系的不断完善，随着化学发光底物、氧化剂、催化剂、增敏剂及固相材料研究的不断深入，性能更加优异的化学发光体系将在今后研究中不断涌现；（2）基因工程抗原、抗体的制备及广泛应用，将进一步促进化学发光免疫分析方法的发展；（3）化学发光免疫分析方法与包括毛细管电泳等其他方法联用，将提高化学发光免疫分析的速度以及灵敏度，拓宽化学发光体系的应用范围。

化学发光免疫分析篇二：化学发光免疫分析
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析
化学发光免疫分析（chemiluminescence immunoassay，CLIA）在近十年来得到了很大发展，与微离子发光酶免疫分析(microparticle luminescence immunoassay, MLIA)、生物发光免
疫分析(bioluminescence immunoassay, BLIA)、增强化学发光分析(enhanced
chemiluminescence, EC)和电化学发光分析(electrochemical luminescence, ECL)等相比，以其灵敏度高（可达10-18mol）、检测速度快、操作简便、所用试剂对人体无危害的优点，
成为非放射性免疫分析技术中最具有发展前途的方法之一。

（一）化学发光免疫分析的基本原理
化学发光指化学反应引起的发光现象，当物质吸收化学反应过
程中释放的化学能之后，能使自身分子受激发而发光；如在生物体中产生此种能源来自生物活体的发光现象，称为生物发光；若产生发光信号的能量来源于电激发，如从多环芳烃的自由基阴离子上除去一个电子，往往产生激发状态的中间物质，当其回到基态时，将产生光辐射，此种发光称为电化学发光。

化学发光反应所发出的光的强度依赖于化学发光反应的速度，而反应速度又依赖于反应物的浓度。

因此，通过检测化学发光强度可以直接测定反应物的浓度，从而进行物质的定性和定量分析。

化学发光与荧光的根本区别是形成激发态分子的激发能源不同。

荧光是发光物质吸收了激发光后使分子产生发射光，化学发光是化学反应过程中所产生的化学能使分子激发产生的发射光。

因此，化学发光反应中反应过程必须产生足够的激发能是产生发光效应的重要
条件。

（二）化学发光兔疫分析中的标记物质
化学发光免疫分析所使用的标记物根据其参与的化学反应不同，可分为三类：①直接参与发光反应的标记物；②以催化作用或能量传递参与发光反应的酶标记物；③以能量传递参与氧化反应的非酶标记物。

后两者又称为间接发光。

这些标记物应用在不同的发光免疫分析仪器中，了解它们各自特性有助于对不同原理的发光免疫分析在分析测定样品时的特性进行评价
和选择。

1．直接参与发光反应的标记物待测样品作为反应物，直接参与
化学发光反应，如下式。

待测样品A或B，通过反应产生激发态产物C* 当C* 跃迁回到基态时，辐射出光子。

A +
B C* + D C*
C + h
这类反应的标记物在化学结构上有产生发光的特殊基团，在发光免疫分析过程中直接参与发光反应。

通常这类物质没有本底发光，在反应中能用于检测低浓度或微量浓度的样品。

最常用的标记物主要有吖啶酯类。

吖啶酯包括吖啶酯I、吖啶酯II和吖啶酰胺III，是一类发光效率很高的发光剂。

吖啶酯I、II分子和吖啶酰胺III均可与抗体（或抗原）结合，生成具
有化学发光活性强、免疫反应特异性高的标记抗体。

2．以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物在这类发光反应中，采用某些酶作为标记
物，这类标记物作为发光反应的催化剂或作为一种能量传递过程中的受体，其本身又直接参与发光反应。

通常用酶标记抗体，检测反应中形成的抗原抗体复合物上的标记酶催化其反应底物后形成的产物，作用于发光物质产生化学发光。

该被测样品的含量和发光效率的强弱与酶催化反应后形成产物的量密切相关。

在该类方法中最常使用的标记酶有辣根过氧化物酶
（HRP）和碱性磷酸酶（ALP）。

3．以能量传递参与氧化反应的非酶标记物这类标记物作为化学发光反应的催化剂或能量传递过程中的中间体（或受体），不直接参与化学发光反应。

在这类反应中参与能量传递反应的标记物含
量与免疫反应中抗原-抗体复合物形成的量呈正相关，并直接与反应底物产生的光子强度相关，该体系中的发光物质在激发态与基态的活动越强，产生的光子就越多，其发
射光的强度与被检测物的浓度呈正相关。

最常用的有三联吡啶钌标记物。

A +
B C* + D C* + F F* + E F* F + h
（三）在临床生化免疫检测中的应用
无论是化学发光酶免疫测定，微粒子化学发光免疫测定和电化学发光免疫测定，目前都是采用将发光技术与免疫反应和计算机技术完美结合的自动化仪器分析，在这些分析技术中，由于其操作的智能化程度高，敏感度高、特异性强、精密度和准确性均可高于RIA，特别是检测灵敏度高，快速，检测试剂稳定并易于进行质量控制，目前已成为免疫检测广泛采用的分析技术。

随着近年来各试剂厂家不断推出许多新开发的诊断试剂盒，使其检测项目涉及面越来越广，可用于内分泌激素类、肿瘤标志物类、心肌标志物类、病毒标志物类、治疗性药物浓度、骨代谢指标和贫血类等方面的检测，是目前免疫化学应用最为广泛的新技术。

四、时间分辨荧光免疫分析
时间分辨荧光免疫分析（time-resolved fluoroimmunoassny，TRFIA）以镧系元素为标记物，因此又称之为解离一增强镧系荧光免疫分析（dissociation－enhancement lanthanide fluoroimmunoassay，DELFIA）。

它是一种全新的非放射性标记免疫
超灵敏度的检测技术。

其主要特点是以稀土元素铕（Eu3+）标记抗原或抗体为示踪剂。

利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光测量法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了荧光信号测量的特异性和检测方法的灵敏度，最小检出值可达10-17mol/L。

具有操作方法简便，标记物制备容易，稳定性好，不污染环境和易于自动化等优点。

目前主要用于蛋白质类、酶、
***类激素、甲状腺激素、类固醇激素、药物等的定量检测。

（一）时间分辨荧光免疫分析原理
通常在检测样品中，含有各种蛋白质和其他化合物，这些物质在较大波长范围内都可产生自发荧光，如血清蛋白可发射短波长荧光（激发波长为280nm，发射波长为320nm～350nm），而胆红素等化合物可发射较长波长荧光（激发波长为330nm～360nm，发射波长为430nm～470nm）。

这些荧光属于非特异荧光，其荧光素寿命短，一般为lns～10ns，最长不超过20ns，因此，普通荧光素发射的荧光与非特异荧光的荧光寿命属于短寿命荧光，在本检测中称背景
荧光。

镧系离子有铕、衫（Sm3+）、镝（Dy3+）等，其荧光寿命很长（10us～1.0ms），比背景荧
光长3～4个数量级。

所以应用荧光的时间分辨技术在背景荧光已经降到很低时再开始检测稀土鳌合物的荧光，从而消除了非特
异性荧光的干扰。

另外，较大的Stocks位移（即激发光波长与发射光波长之差）和较窄的发射峰等都增大了检测的信噪比。

由于使用解离-增强原理（即镧系元素鳌合物被解离后形成一种处于保护性的胶态分子团中新的高强荧光鳌合
物）使得检测的灵敏度进一步增加，可达5 10-14mol/L。

（二）时间分辨荧光免疫分析的主要分析方法
1．双位点夹心分析法以甲胎蛋白（AFP）为例。

采用针对AFP 分子上不同决定簇的两种单克隆抗体，一种抗体包被在微孔板上，另一种用作制备抗AFP-Eu3+标记物。

在微孔板中加入待测样品和标记物，AFP通过其两个结合位点分别与固相和标记物中的抗AFP 结合，结合到固相上的抗AFP-Eu3+标记物与AFP含量成正比，洗涤除去游离的标记物；加入增强液，用时间分辨荧光测定仪测定固相上结合标记物的荧光强度，它与AFP浓度呈正比。

一系列AFP 标准品用于制作标准曲线，通过样品荧光强度可以从标准曲线查出样品AFP含量。

2．竞争分析法以皮质醇测定为例。

Eu3+标记抗皮质醇抗体，微孔板上包被皮质醇。

在微孔中加入样品和Eu3+标记物，样品与固相上的皮质醇对有限量抗皮质醇-Eu3+标记物进行竞争性结合，Eu3+标记物与固相结合量与样品皮质醇含量成反比，洗涤除去游离的Eu3+标记物，加入增强液，用时间分辨荧光仪测定荧光强度，荧光强度与样品皮质醇含量呈反比。

一系列皮质醇标准品用于制作标准曲线，根据样品荧光强度可以从标准曲线查出皮质醇含量。