蛋白质的定性和定量分析
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➢ 蛋白质的分子量范围 15～200 KD之间
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
➢ 多亚基蛋白质分子量检测 ❖ SDS和巯基乙醇 ❖ 用其它方法测定分子量进行参照
➢ SDS-PAGE测定的准确性 ❖ 电荷异常或构象异常 ❖ 带有较大辅基的蛋白质 ❖ 某些结构蛋白
• 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸)检测法
这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质 的影响
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与 Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。 而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成 稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的 光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
注意事项 • 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
二、Bradford检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种 不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条 件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后， 产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物 在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液 中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光 吸收值大小计算蛋白的含量
如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值
• 为促进BCA法的反应进程，可将 样品适当加热
小结（Summary）
掌握常用的测定方法 不同方法的操作步骤 操作过程的注意事项
其它蛋白质的定性定量方法
1. 蛋白质的染色定量 2. ELISA测定 3. 放射免疫测定
第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
质谱 (ESI-MS)
沉降平衡超速离心 排阻层析
动态弹性光散射 孔径梯度电泳
一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量 1. 不连续系统原理 2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶 制备浓缩胶 装板 加样 电泳 卸板并进行凝胶染色
SDS-PAGE
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量
1系
2. 凝胶过滤测定分子量的操作 装柱 平衡 加样 平衡 洗脱 收集样品并计算Ve 绘制标准曲线
3. 注意事项
➢ 柱床表面不能干燥
➢ Sephadex 溶胀 ❖ 凝胶的选择 ❖ G值的意义
➢ 凝胶柱的再生与保 存
• 反应10～15 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀
• 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确
三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已 得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质 沉淀将干扰物质去除
原理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然 后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色， 这种深蓝色的复合物在745 ～750 nm处有最大 的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度 成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算 蛋白质的含量
蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
➢ 蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % )
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate) 十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate)
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带 负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成 的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电 荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异
芳香族氨基酸的紫外吸收
所需时间 • 几分钟
优 点 • 快速 • 对蛋白质无破坏性
缺 点 • 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 灵 敏 度 • 0.2 mg/ml～2 mg/ml
计算方法 • 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260
与蛋白牢固结合当其浓度大mmoll时sds与蛋白质的结合比例为14gsds1g蛋白质由于十二烷基硫酸根带负电荷使得样品中各种蛋白质与sds形成的sds蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异sds蛋白质复合物分子构型也几乎相同雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物而且具有相同的荷质比因此在sdspage中sds蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关而不再受所带电荷及分子形状的影响且在一定条件下迁移率与分子量呈对数线性关系watchsdspage相对迁移率的计算watchsdspageanalysissdspageelectrophoresis样品中高浓度的阳离子可能会导致sds的沉淀应在加入样品缓冲液之前将其除去蛋白质的分子量范围15200kd之间平衡洗脱收集样品并计算v
➢ 标准品的选择及处理 ➢ 待测样品的制备 ➢ 电泳分离及染色 ➢ 相对迁移率的计算
Watch SDS-PAGE操作
Analysis for SDS-PAGE electrophoresis
5. 注意事项
➢ 选择合适的胶浓度
➢ SDS与蛋白质之间的结合程度 ❖ 二硫键是否完全被还原 ❖ 溶液中SDS的浓度 ❖ 溶液的离子强度
SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄 烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的 荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复 合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再 受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件 下，迁移率与分子量呈对数线性关系
Watch SDS-PAGE原理
4. SDS-PAGE测定分子量的操作
蛋白质的定性定量分析
➢ 蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在 的是何种蛋白质
➢ 蛋白质定量分析 (quantitative analysis)
确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋 白成分的含量
➢ 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） ➢ 蛋白质相对分子量测定 (SDS-PAGE) ➢ 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） ➢ 蛋白质的免疫印迹分析 (western blotting)
= 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
一、紫外光谱 (A280)吸收法
这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰
原理
色氨酸、酪氨酸的最 大吸收峰在280 nm附近
大多数蛋白质含有这两 种氨基酸残基，所以测定 蛋白质溶液280 nm的光吸 收值是分析溶液中蛋白质 含量的快速简便的方法
所需时间 • 10 min 优 点 • 快速（反应时间仅需2 min）
• 敏感，几乎没有蛋白质损失 缺 点 • 对各种纯化蛋白质反应不同
• 用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性 灵 敏 度 • 25 ug/ml～200 ug/ml
计算方法 • 标准曲线法
注意事项 • 标准曲线在2.5 ug～15 ug BSA浓度 范围内保持线性关系
所需时间 • 40 min
优 点 • 一种可靠的蛋白质定量方法 • 不同蛋白质之间差别很小
缺 点 • 干扰物质多 • 反应速度慢 • 某些试剂不稳定 • 使蛋白质发生不可逆变性
灵 敏 度 • 5 ug/ml～100 ug/ml
计算方法 • 标准曲线法
注意事项 • 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱
优 点 • 单一试剂 • 终产物稳定 • 与Lowry法相比几乎没有干扰物质的 影响
缺 点 • 反应时间长 • 蛋白质发生不可逆的变性
灵 敏 度 • 标准检测： 10 ～ 1200 ug/ml • 微量检测： 0.5 ～10 ug/ml
计算方法 • 标准曲线法 注意事项 • 与Lowry相比，采用BCA法时，
➢ 样品中高浓度的阳离子可能会导致SDS的沉 淀，应在加入样品缓冲液之前将其除去
➢ 多亚基蛋白质分子量检测 ❖ SDS和巯基乙醇 ❖ 用其它方法测定分子量进行参照
➢ SDS-PAGE测定的准确性 ❖ 电荷异常或构象异常 ❖ 带有较大辅基的蛋白质 ❖ 某些结构蛋白
• 许多干扰物质降低颜色反应 • 高盐浓度可引起沉淀
四、BCA (二喹啉甲酸)检测法
这是近年来新研制的一种改进的Lowry 测定法，反应简单而且几乎没有干扰物质 的影响
原理
在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与 Cu2＋生成络合物，同时将Cu2＋还原成Cu＋。 而BCA试剂可敏感特异地与Cu＋结合，形成 稳定的有颜色的复合物，在562 nm处有高的 光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比， 可根据吸收值的大小来计算蛋白质的含量
注意事项 • 石英比色杯 • 调零所用溶液 • 配制标准蛋白所用溶液 • 光密度范围
二、Bradford检测法
这是一种迅速、可靠的通过染色法测定 溶液中蛋白质含量的方法
原理
该法是基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种 不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条 件下，可配成淡红色溶液，当与蛋白质结合后， 产生蓝色化合物，反应迅速而稳。蓝色复合物 在595 mn波长处具有最大光吸收值，并与溶液 中蛋白质浓度成正比，因此可检测595 mn的光 吸收值大小计算蛋白的含量
如果样品中含有脂类物质将明显 提高光吸收值
• 为促进BCA法的反应进程，可将 样品适当加热
小结（Summary）
掌握常用的测定方法 不同方法的操作步骤 操作过程的注意事项
其它蛋白质的定性定量方法
1. 蛋白质的染色定量 2. ELISA测定 3. 放射免疫测定
第二节 蛋白质相对分子量测定
分子量测定 (molecular weight, MW)
质谱 (ESI-MS)
沉降平衡超速离心 排阻层析
动态弹性光散射 孔径梯度电泳
一、SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子量 1. 不连续系统原理 2. SDS-PAGE凝胶的制备
制备分离胶 制备浓缩胶 装板 加样 电泳 卸板并进行凝胶染色
SDS-PAGE
3. SDS-PAGE基本原理
➢ 影响迁移率的因素
二、凝胶过滤层析测定蛋白质的相对分子量
1系
2. 凝胶过滤测定分子量的操作 装柱 平衡 加样 平衡 洗脱 收集样品并计算Ve 绘制标准曲线
3. 注意事项
➢ 柱床表面不能干燥
➢ Sephadex 溶胀 ❖ 凝胶的选择 ❖ G值的意义
➢ 凝胶柱的再生与保 存
• 反应10～15 min后开始出现沉淀， 尤其是高浓度蛋白质溶液在酸性条 件下易发生沉淀
• 若选用目的蛋白来做标准曲线或用 另一种方法来校正，所测蛋白浓度 较准确
三、Lowry检测法
这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已 得到广泛应用，在检测之前可通过蛋白质 沉淀将干扰物质去除
原理
首先在碱性溶液中形成铜-蛋白复合物，然 后这一复合物还原磷钼酸-磷钨酸试剂(Folin酚试剂)，产生钼蓝和钨蓝复合物的深蓝色， 这种深蓝色的复合物在745 ～750 nm处有最大 的吸收峰，颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度 成正比，可根据750 nm的光吸收值大小计算 蛋白质的含量
蛋白质的含量测定
蛋白质的含量测定
基于蛋白质的 基于蛋白质的 基于蛋白质的 元素组成特点 化学显色反应 光吸收特性
➢ 蛋白质元素组成的特点
各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16％ 由于体内的含氮物质以蛋白质为主，因此 只要测定生物样品中的含氮量，就可以根据 以下公式推算出蛋白质的大致含量： 100克样品中蛋白质的含量 ( g % )
➢ SDS 十二烷基硫酸钠 (sodium dodecyl sulfate) 十二烷基磺酸钠 (sodium dodecyl sulfate)
SDS作用：与蛋白牢固结合，当其浓度大 于1 mmol/L 时，SDS与蛋白质的结合比例为 1.4g SDS/1g蛋白质，由于十二烷基硫酸根带 负电荷，使得样品中各种蛋白质与SDS形成 的SDS-蛋白质复合物都带有相同密度的负电 荷，掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异
芳香族氨基酸的紫外吸收
所需时间 • 几分钟
优 点 • 快速 • 对蛋白质无破坏性
缺 点 • 不是严格的定量，适用于测定蛋 白质粗提液
• 核酸可引起强干扰作用 灵 敏 度 • 0.2 mg/ml～2 mg/ml
计算方法 • 标准曲线法
• 蛋白质浓度 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260
与蛋白牢固结合当其浓度大mmoll时sds与蛋白质的结合比例为14gsds1g蛋白质由于十二烷基硫酸根带负电荷使得样品中各种蛋白质与sds形成的sds蛋白质复合物都带有相同密度的负电荷掩盖了蛋白质分子间天然的电荷差异sds蛋白质复合物分子构型也几乎相同雪茄烟形的长椭圆棒状的复合物而且具有相同的荷质比因此在sdspage中sds蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关而不再受所带电荷及分子形状的影响且在一定条件下迁移率与分子量呈对数线性关系watchsdspage相对迁移率的计算watchsdspageanalysissdspageelectrophoresis样品中高浓度的阳离子可能会导致sds的沉淀应在加入样品缓冲液之前将其除去蛋白质的分子量范围15200kd之间平衡洗脱收集样品并计算v
➢ 标准品的选择及处理 ➢ 待测样品的制备 ➢ 电泳分离及染色 ➢ 相对迁移率的计算
Watch SDS-PAGE操作
Analysis for SDS-PAGE electrophoresis
5. 注意事项
➢ 选择合适的胶浓度
➢ SDS与蛋白质之间的结合程度 ❖ 二硫键是否完全被还原 ❖ 溶液中SDS的浓度 ❖ 溶液的离子强度
SDS-蛋白质复合物分子构型也几乎相同(雪茄 烟形的长椭圆棒状的复合物)，而且具有相同的 荷质比，因此在SDS-PAGE中，SDS-蛋白质复 合物的电泳迁移率只与其分子量有关，而不再 受所带电荷及分子形状的影响，且在一定条件 下，迁移率与分子量呈对数线性关系
Watch SDS-PAGE原理
4. SDS-PAGE测定分子量的操作
蛋白质的定性定量分析
➢ 蛋白质定性分析 (qualitative analysis)
确定样品中是否有蛋白质存在，以及存在 的是何种蛋白质
➢ 蛋白质定量分析 (quantitative analysis)
确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋 白成分的含量
➢ 蛋白质含量的测定方法（重点掌握） ➢ 蛋白质相对分子量测定 (SDS-PAGE) ➢ 等电聚焦电泳 (IEF)（一般了解） ➢ 蛋白质的免疫印迹分析 (western blotting)
= 每克样品含氮克数× 6.25×100
1/16%
一、紫外光谱 (A280)吸收法
这一方法可用来快速检测溶液中是否含有 蛋白质成分。通常用于柱层析过程中检测蛋 白质的洗脱峰
原理
色氨酸、酪氨酸的最 大吸收峰在280 nm附近
大多数蛋白质含有这两 种氨基酸残基，所以测定 蛋白质溶液280 nm的光吸 收值是分析溶液中蛋白质 含量的快速简便的方法
所需时间 • 10 min 优 点 • 快速（反应时间仅需2 min）
• 敏感，几乎没有蛋白质损失 缺 点 • 对各种纯化蛋白质反应不同
• 用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性 灵 敏 度 • 25 ug/ml～200 ug/ml
计算方法 • 标准曲线法
注意事项 • 标准曲线在2.5 ug～15 ug BSA浓度 范围内保持线性关系
所需时间 • 40 min
优 点 • 一种可靠的蛋白质定量方法 • 不同蛋白质之间差别很小
缺 点 • 干扰物质多 • 反应速度慢 • 某些试剂不稳定 • 使蛋白质发生不可逆变性
灵 敏 度 • 5 ug/ml～100 ug/ml
计算方法 • 标准曲线法
注意事项 • 在加入试剂30 min后呈色达到饱 和，时间延长颜色信号减弱
优 点 • 单一试剂 • 终产物稳定 • 与Lowry法相比几乎没有干扰物质的 影响
缺 点 • 反应时间长 • 蛋白质发生不可逆的变性
灵 敏 度 • 标准检测： 10 ～ 1200 ug/ml • 微量检测： 0.5 ～10 ug/ml
计算方法 • 标准曲线法 注意事项 • 与Lowry相比，采用BCA法时，