波棱素脂质体冻干粉针的制备及初步安全性和药效学研究

波棱素脂质体冻干粉针的制备及初步安全性和药效学研究
采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液，以包封率、粒径等为评价指标，筛选最佳冻干保护剂；对冻干粉针进行稳定影响因素实验，并初步研究了HPT脂质体冻干粉针的安全性以及对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果。

质量分数5%乳糖+5%蔗糖为最佳冻干保护剂，按照最优处方制得的脂质体冻干粉针复水后，平均包封率为（99.70±0.50）%，平均粒径为（107.0±1.2）nm，平均电位为（-6.11±0.72）；脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均较为敏感；脂质体冻干粉针复水后不会引起溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响；HPT脂质体对CCl4所致急性肝损伤模型小鼠的治疗效果明显，血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）指标水平均明显改善，治疗效果明显优于HPT原药。

按照最优处方制备的波棱素脂质体冻干粉复水后粒径均匀，包封率符合《中国药典》要求，且具有较高的安全性，能显著提高HPT的治疗效果，保存时应该注意低温、避光、密封保存。

标签：波棱素；脂质体；粉针剂；安全性；药效学
波棱素（herpetin，HPT）是从藏药波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall.子中的木脂素分离出来的活性单体成分。

药理学活性研究表明，其具有抗肝损伤、保肝降酶、抑制乙型肝炎病毒复制的作用[1]。

但HPT的水溶性很差，口服生物利用度低，为了克服HPT的上述缺点，并增强其治疗肝脏疾病的效果，作者在前期研究中利用薄膜蒸发法制备HPT脂质体。

本研究进一步对HPT脂质体冻干粉针制剂进行筛选，并初步考察了HPT脂质体冻干粉针的安全性及对肝损伤模型动物的治疗效果。

1 材料
Acquity型超高效液相色谱（美国，Waters）；ZS90激光粒度仪（英国，Malvern）；冷冻干燥机；LHH药品稳定性试验箱（上海一恒科学仪器有限公司）；可见分光光度计（上海箐华科技仪器有限公司）；台式高速离心机TGL-16G（无锡市瑞江分析仪器有限公司）。

波棱素对照品（自制，纯度为98.59%）；波棱素原料药（自制，纯度>95%）；大豆卵磷脂购自德国Lipoid公司；胆固醇购自美国Sigma公司；丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）试剂盒购自长春汇力生物技术有限公司。

超滤离心管（10 kDa）购自Millpore公司，乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为重蒸水。

ICR小鼠，SPF级，体重18～22 g，雄性；家兔，体重1.8～2.2 kg，雄性，均购自于成都达硕实验动物研究中心，动物合格证号分别为SCXK（川）2013-24，SCXK（川）2013-14。

2 方法与结果
2.1 HPT脂质体溶液的制备
根据前期研究结果，采用薄膜分散法制备HPT脂质体溶液[2]：称取波棱素单体24.4 mg、胆固醇195.1 mg、大豆磷脂780.5 mg，置于圆底烧瓶中，加入100 mL氯仿溶解，水浴减压除去氯仿，成膜，加入0.5%泊洛沙姆F68 50 mL脱膜，将得到的类脂膜初悬液水浴超声20 min，过0.22 μm滤膜，即得HPT脂质体溶液。

经测定，HPT脂质体平均包封率（94.50±2.15）%，平均粒径（119.2±10.7）nm，多分散系数为0.156±0.075。

2.2 冻干粉针处方筛选
选择常用的葡萄糖、甘露醇、乳糖、蔗糖为冻干保护剂选择不同种类、不同浓度的冻干保护剂，见表1，溶于HPT脂质体溶液中，冷冻干燥后，制得HPT 脂质体冻干粉针，观察以下评价指标：①外观及色泽；②再分散性；③粒径；④包封率，筛选出适合的冻干保护剂。

选择5%乳糖+5%蔗糖作为复合冻干保护剂，HPT脂质体复水后，粒径最小，包封率最高，外观和再分散性也较好，故选择5%乳糖+5%蔗糖作为HPT脂质体的冻干保护剂。

2.3 初步稳定性研究
取HPT脂质体冻干粉针样品进行影响因素实验考察，分别选取①高温试验条件：40 ℃；②高湿试验条件：相对湿度（RH）75%；③光照试验条件：4 500 lx的光照。

将冻干粉针样品分别放置上述条件下，于第5，10天取出样品，观察HPT脂质体冻干粉针变化情况，测定渗漏率，见表2，在40 ℃条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率增加，含量略降低；在相对湿度75%的高湿条件下放置后，HPT脂质体冻干粉针外观塌陷，再分散困难，脂质体泄漏率增加；在强光条件下放置后，冻干粉针外观及再分散性无明显变化，但脂质体泄漏率亦增加，含量亦明显降低。

因此，HPT脂质体冻干粉针对温度、湿度及光照均敏感，应低温、密封、避光保存。

2.4 溶血试验
取家兔血液10 mL置于含有枸橼酸葡萄糖抗凝的离心管中，4 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，下层红细胞用生理盐水洗涤3次，并按体积比用生理盐水稀释成2%红细胞混悬液。

所有试管中均加入红细胞混悬液各2.5 mL，设置样品管、阴性对照试管和阳性对照试管[3]。

样品管中分别加入适量HPT脂质体冻干粉针复水液及适量生理盐水，使之HPT脂质体终浓度分别为2%，4%，6%；阴性对照试管仅加入生理盐水；阳性对照试管加入蒸馏水。

混匀后，立即将试管置于37 ℃恒温水浴箱水浴30 min后，取出适量样品液离心去除不溶物，于542 nm下测定各样品吸光度，计算溶血率，见表3，HPT脂质体在各个测定浓度下的溶血率均低于5%，可判断HPT脂质体无溶血作用。

2.5 全血凝血时间
取波棱素脂质体冻干粉针复水液10 μL，以等量生理盐水作为对照，加入24孔细胞培养板中。

另取枸橼酸葡萄糖抗凝家兔血适量，按体积比10∶1加入0.1
mol·L-1CaCl2溶液进行活化，混匀，立即各取100 μL加入上述含有样品的培养板中，分别于5，15，25，35，45，55 min时间点加入3 mL 37 ℃预热的蒸馏水于对应的样品孔中。

5 min后取出适量样品液离心去除不溶物，于542 nm下测定各样品光密度值。

以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制全血凝固时间曲线，见图1，HPT脂质体冻干粉针复水液样品的全血动态凝血曲线与对照组相似，可知HPT脂质体对全血凝固时间无显著影响。

2.6 血管刺激试验
取雄性家兔1只，每日右耳耳缘静脉注射HPT脂质体复水液20.0 mg·kg-1，左耳耳缘静脉注射生理盐水注射液，作为空白对照组，每天1次，连续滴注4 d。

末次给药后24 h，耳缘静脉注入空气处死家兔，剪取距注射部位1.3 cm处兔耳，置于10%福尔马林溶液中固定，石蜡包埋，HE染色。

光镜下观察药物对兔耳血管的刺激性反应，结果见图2，连续注射HPT脂质体后，耳缘静脉血管内皮完整，内皮细胞结构清楚，血管腔无扩张，无坏死脱落，未见明显炎细胞浸润，可判断HPT脂质体冻干粉针对血管无刺激性。

2.7 HPT脂质体冻干粉针对四氯化碳致肝损伤的保护作用
2.7.1 动物分组造模及给药ICR小鼠50只，雄性，18～22 g。

采用随机数字法将小鼠分成5组：正常组、模型组、HPT对照组、阳性对照组、治疗组，每组10只小鼠。

HPT对照组尾静脉注射20 mg·kg-1的HPT 10%甘油生理盐水溶液（相当于0.4 g·L-1的HPT）；阳性对照组尾静脉注射20 mg·kg-1清开灵注射液；治疗组尾静脉注射20 mL·kg-1的HPT脂质体原药溶液，正常组和模型组注射等体积生理盐水，均每天1次，连续给药7 d。

末次给药后1 h，除空白组，其余各组腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液20 mL·kg-1，造成急性肝损伤模型[4]。

2.7.2 指标测定及评价腹腔注射0.1%CCl4橄榄油溶液后，禁食不禁水16 h 后，摘眼球取血，血样室温静置30 min，4 ℃4 000 r·min-1离心10 min后，分离血清，备用。

按试剂盒测定说明书分别测定血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）的活力，结果见表4。

正常组小鼠血清中的AST，ALT，ALP活力明显低于模型组（P＜0.01），说明四氯化碳造急性肝损模型构建成功；HPT对照组的AST，ALT，ALP活力较模型组相比，有改善趋势，但无统计学意义；治疗组的AST，ALT，ALP活力较HPT对照组和模型组均有明显改善，效果与阳性对照组趋势一致，甚至优于阳性对照组，有效降低CCl4引起的酶活性升高，改善肝脏损伤。

结果说明，HPT在脂质体的被动肝脏靶向作用下，增强了疗效。

3 讨论
脂质体混悬液物理化学性质不稳定，不利于储存和运输，故制备成冻干粉针。

制成冻干粉针的过程中，零下的温度会造成磷脂双分子层的破裂，加入的蔗糖和乳糖属于糖类大分子，能在脂质体混悬液中形成无形的骨架，能够起到冻干保护剂的作用，从而维持磷脂双分子的稳定。

但受到本身原料的限制，冻干粉针也不
能长时间处于高温、高湿和光照的环境。

初步安全性实验结果表明，波棱素脂质体冻干粉针未造成家兔的溶血和凝血，对注射部位也没有明显的刺激反应。

因此，所制备的波棱素脂质体冻干粉是安全可靠的，为今后可能的临床应用奠定了安全数据基础。

ALT，AST和ALP是自身免疫活性酶，主要存在于心肌、肝脏，血液中含量很低，当肝脏受到破坏时，才会在血液中急剧上升。

CCl4致急性肝损伤是一种肝脏造模的经典方法，其原理在于CCl4其强氧化的自由基破坏肝脏细胞膜，从而导致其中的ALT，AST和ALP从肝脏流入血液。

本实验结果表明HPT脂质体能较阳性组和HPT原药组，显著降低小鼠血清中ALT，AST和ALP水平，这表明其对肝损伤有明显的保护作用。

这应该与脂质体制剂本身具有肝脏靶向性有关，能够富集HPT在肝脏部位，增强HPT清除强氧化自由基的效果。

本研究为HPT脂质体保护急性肝损伤疾病提供实验依据，具有临床指导意义。

[参考文献]
[1] 中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准（藏药）.第1册[S]. 北京：中国医药科技出版社，1995：64.
[2] 张鑫，谭睿，顾健，等.波棱素脂质体的制备工艺及处方优化研究[J]. 中国中药杂志，2014，39（6）：1007.
[3] 陈奇. 中药药理研究方法学[M]. 北京：人民卫生出版社，1996：168.
[4] 冀润利，赵青娥. 水飞蓟素对四氯化碳致小鼠肝损伤的保护作用[J]. 中国应用生理学杂志，2012，28（3）：279.。