CD59基因抗HeNe激光诱导凋亡的作用

CD59基因抗HeNe激光诱导凋亡的作用
【摘要】目的探讨CD59基因抗He Ne激光诱导凋亡的作用。

方法将小鼠随机分成两组,小鼠背部脾区皮下分别接种HeLa细胞（Ⅰ组）、转CD59基因HeLa细胞（Ⅱ组）,接种24 h后采用24 mW的He Ne 激光器照射小鼠脾区(瘤区),然后采用免疫组化方法检测凋亡相关基因 Fas、B细胞淋巴瘤白血病基因2（bcl2）、细胞核因子κB （NFκB）的表达。

结果Ⅰ组瘤块质量及bcl2、NFκB表达明显低于Ⅱ组,两组比较差异有显著性（t=9.169,Z=－2.328、－2.367,P ＜0.05）。

Ⅱ组Fas的表达与Ⅰ组比较无显著差异（Z=－0.643,P＞0.05）。

结论 CD59基因可促进肿瘤细胞的生长及bcl2、NFκB的表达,具有抗He Ne激光诱导凋亡的作用。

【关键词】抗原 CD95 基因 bcl 2 NFκB 激光
［ABSTRACT］ObjectiveTo study the effect of CD59 gene on apoptosis of HeLa cell induced by He Ne Laser. MethodsHeLa cells were injected subcutaneously into the back of the mice in groupⅠ, and HeLa cells transfected with CD59gene into the back of the mice in group Ⅱ. After 24 h of the injection, the mice received He Ne laser radiation. Expressions of Fas, bcl 2 and NFκ B in tumor tissue were demonstrated via immunohistochemistry technique. ResultsCompared with group Ⅱ, tumor weight and the expressions of bcl 2 and NFκB in group Ⅰwere significantly lower (t=9.169；Z=－2.328,－2.367；P＜
0.05), while difference in the Fas expression between the two groups was not significant (Z=－0.643, P＞0.05).ConclusionCD59 gene may promote the expressions of bcl 2 and NFκB, suggesting its anti apoptosis effect.
［KEY WORDS］antigens, CD95； genes, bcl2； NF kappa B; lasers
CD59是补体终末段的一种调节蛋白，它具有抑制补体攻膜复合物的形成、保护正常组织免受补体溶解的作用。

近年来对CD59与肿瘤关系的研究比较深入，发现其与肿瘤的生长失控及转移密切相关[1]。

本研究采用He Ne激光照射小鼠瘤区的方法，探讨CD59基因抗He Ne激光诱导凋亡的作用。

1 材料与方法
1.1 实验材料
HeLa细胞、转CD59基因Hela细胞由本室保存[2]。

凋亡相关基因 Fas、B细胞淋巴瘤白血病基因2（bcl2）、细胞核因子κB （NFκB）免疫组化试剂盒购于武汉博士德公司。

HNZSQⅡ型氦氖激光照射器为上海医用激光仪器厂产品。

1.2 动物选择与分组
取BALB/C纯系小鼠32只，体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为2组。

Ⅰ组每只小鼠脾区皮下注射6×106的HeLa细胞，Ⅱ组接种转CD59基因HeLa细胞，接种24 h后分别进行激光照射。

1.3 激光照射方法
采用氦氖激光照射器,输出功率为24 mW，能量密度为76.43 J/cm2，照射距离为50 cm，光斑直径为0.5 cm，原束照射。

照射部位为脾区(瘤区)，每日照射激光1次，每次10 min共15 d，实验第16天处死小鼠。

1.4 Fas、bcl2、NFκB蛋白免疫组织化学检测
检测步骤按试剂盒说明书操作。

1.5 结果判定
免疫组化染色胞浆或（和）胞膜呈棕黄色为阳性结果。

参照文献[3，4]的方法，随机选取5个高倍视野（400倍），首先根据阳性细胞所占的百分比记分，阳性细胞数<5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。

再根据阳性细胞显色强度记分：无着色为0 分，轻度染色为 1 分，中度染色为2 分，重度染色为 3 分，两者得分之和即为阳性蛋白表达结果，其中<1 分为阴性，2～3 分为弱阳性（+），4～5分为中等阳性（），6～7 分为强阳性（）。

2 结果
2.1 两组成瘤率及肿瘤质量比较
Ⅰ、Ⅱ组小鼠的成瘤率分别为87.5%、81.1%，瘤块的质量分别为(0.848±0.047)g、（1.239±0.058）g,两组的瘤质量比较差异有显著意义（t=9.169，P＜0.05）。

2.2 两组肿瘤组织中Fas、bcl2、NFκB蛋白表达
Fas、bcl2蛋白的表达定位于胞膜及（或）胞浆，阳性细胞多
为弥漫分布，少数呈局灶性分布，其中两组Fas蛋白阳性染色程度无明显差别（图1、2）；Ⅱ组bcl2蛋白阳性染色程度较Ⅰ组明显加深（图3、4）。

NFκB蛋白的表达定位于胞核，阳性细胞的表达呈片状或簇状分布，Ⅱ组染色程度较Ⅰ组明显加深（图5、6）。

图1 Fas在Ⅰ组肿瘤组织中表达免疫组织化学染色×100 图2 Fas在Ⅱ组肿瘤组织中表达免疫组织化学染色×100 图3 bcl2在Ⅰ组肿瘤组织中表达免疫组织化学染色×100 图4 bcl2在Ⅱ组肿瘤组织中表达免疫组织化学染色×100 图5 NFκB在Ⅰ组肿瘤组织中表达免疫组织化学染色×100 图6 NFκB在Ⅱ组肿瘤组织中的表达免疫组织化学染色×100
2.3 Fas、bcl2、NFκB蛋白在肿瘤细胞中表达的比较
在肿瘤组织中，Ⅱ组Fas蛋白的表达与Ⅰ组比较无显著差异（Z=－0.643，P＞0.05），而Ⅱ组bcl2、NFκB的表达较Ⅰ组显著升高(Z=－2.328、-2.367，P＜0.05)。

见表1。

表1 两组肿瘤组织Fas、bcl2、NFκB蛋白表达的比较 3 讨论
Fas、bcl2、NFκB基因是与细胞凋亡相关的信号分子。

免疫细胞具有Fas配体，其可与肿瘤细胞Fas结合，通过激活caspase 引起细胞凋亡[5]。

bcl2基因在细胞抗凋亡中扮演重要角色，主要通过以下几种方式发挥抗凋亡作用:①bcl2基因能与细胞中bax基因结合，这种结合对bcl2基因抗凋亡起重要调控作用,其比值决定了细胞接受凋亡信号后的存活与否,如果bax基因占优势时细胞死亡，而bcl2基因占优势时细胞生存。

②凋亡中DNA的消化需要相关的
Ca2+依赖性核酸内切酶的参与,而bcl2基因也可以阻断Ca2+从内质网的释出,使依赖于Ca2+的核酸内切酶活性降低,从而阻断细胞凋亡。

③bcl2基因是通过调节抗氧化途径来抑制细胞凋亡[6,7]。

近年来发现，NFκB的激活可以促进肿瘤的生长，在肿瘤的治疗中是研究的热点，其具体机制尚在探讨中[8,9]。

CD59是补体终末段的一种调节蛋白，它具有抑制膜攻击复合物形成，保护正常组织免受补体溶解的作用。

近年来，国外报道已在多种实体瘤细胞中，如子宫内膜癌、前列腺癌、黑色素瘤及肠道肿瘤等发现有CD59分子的过表达，并与肿瘤细胞的抗凋亡及肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关[10，11]。

因此，CD59分子已逐渐成为研究肿瘤细胞抗凋亡、逃逸自身免疫监视及肿瘤导向治疗中新的热点。

本研究旨在探讨肿瘤细胞表面CD59表达对He Ne激光杀伤肿瘤效应的影响。

结果显示，Ⅰ组瘤质量及bcl2、NFκB蛋白的表达较Ⅱ组明显减少，差别有显著意义；Ⅰ组Fas表达与Ⅱ组比较差别无显著意义。

这表明肿瘤细胞表面高表达CD59可以促进肿瘤细胞抗凋亡信号的形成，抑制肿瘤细胞的凋亡，拮抗He Ne激光杀伤肿瘤的效应，此结果与国内外报道一致。

总之，本研究从新的角度证实了CD59具有拮抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞生长的作用。

【参考文献】
[1]FONSATTI E, ALTOMONTE M, CORAL S. Emerging role of protectin (CD59) in humoral immunotherapy of solid
malignancies[J]. Clin Ter, 2000,151(3):187193.
[2] 李冰,张学成,高美华. 藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究[J]. 高技术通讯, 2006,16(2):196200.
[3]FROMWITZ F V B, VIOLA M V, CHAO S, et al. Ras P21 expression in the progression of breast cancer[J]. Human Pathol, 1987,18:12681271.
[4]姚济芬,郑伟,石一复,等. 血管内皮生长因子和基质金属蛋白酶MMP2,MMP9在子宫颈癌中的表达的免疫组化研究[J]. 中国实验诊断学, 2002,6(2):7275.
[5]HERR I, DEBATIN K M. Cellular stress response and apoptosis in cancer therapy[J]. Blood, 2001,98(9):26032614.
[6]CHEUNG H H, ARORA V, KORNELUK R G. Abnormalities of cell structures in tumors: apoptosis in tumors[J]. EXS, 2006(96):201221.
[7]陈燕,郭云良. 脑缺血再灌注后神经细胞bcl 2 和p53 mRNA 的表达[J]. 青岛大学医学院学报, 2002,38(2):124126.
[8]LIANG Y, ZHOU Y, SHEN P. NF kappa B and its regulation on the immune system[J]. Cell Mol Immunol, 2004,1(5):343350.
[9]BUBICI C, PAPA S, PHAM C G, et al. The NF kappa
B mediated control of ROS and JNK signaling[J]. Histol Histopathol, 2006,21(1):6980.
[10]尉国昌,江富川,刘成玉,等. 急性心肌梗死病人补体活化片
段浓度的动态变化[J]. 齐鲁医学杂志, 1999,14(2):9192.
[11]GORTER A, MERI A. Immune evasion of tumor cells using membrane bound complement regulatory proteins[J]. Immunol Today, 1999,20(12):576582.。