论文h5型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析(论文)

本科生毕业设计（论文）
题目h5型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析
学院动物医学院
专业动物医学班级动医（061）班姓名如则·塔伊尔学号063631127
指导教师加尔肯职称讲师
2011年4月28日
新疆农业大学教务处制
目录
摘要 (1)
关键词 (1)
前言 (1)
1 材料和法 (2)
1.1毒株 (2)
1.2 疫苗 (2)
1.3 试验动物 (2)
1.4疫苗在1日龄无母源抗体商品鸡的免疫效力 (2)
1.5疫苗在1日龄含母源抗体商品鸡的免疫效力 (2)
1.6 血清学检测 (2)
1.7保护率计算 (2)
1.8统计分析 (2)
2试验结果 (3)
2.1 rFPV-HA和灭活疫苗诱导的HI抗体应答 (3)
2.2 rFPV-HA与灭活疫苗的免疫效力 (4)
3讨论 (5)
3. 1 rFPV-HA与灭活疫苗诱导HI抗体应答能力 (5)
3.2 rFPV-HA与油乳剂灭活疫苗免疫效力比较 (5)
3.3 rFPV-HA与油乳剂灭活疫苗应用前景分析 (5)
谢辞 (7)
参考文献 (8)
H5型高致病性禽流感免疫抗体检测及分析
如则·塔依尔
摘要：利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因(HA)的重组鸡痘病毒(rFPV-HA和全病毒灭活疫苗免疫商品鸡,比较两种疫苗的保护效力。

结果发现,利103PFU和106PFU的rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡和含母源抗体商品鸡,HI抗体应答水平均低于灭活疫苗免疫组.利用H5亚型禽流感病毒经肌肉注射攻毒后,rFPV-HA免疫的无母源抗体商品鸡获得了完全保护(100%),高于灭活疫苗保护率
(94.7%);但rFPV-HA免疫含母源抗体商品鸡诱导的保护率
(11.4%～15.8%)低于灭活疫苗免疫组的保护水平(68.45)。

结果表
明,rFPV-HA诱导HI抗体的能力低于灭活疫苗;但rFPV-HA免疫无母源抗体商品鸡的保护率完全达到灭活疫苗保护水平,显示出了良好的应用前景;灭活疫苗和rFPV-HA均受到母源抗体的干扰,不适于在母源抗体处于高峰期时使用。

关键词：H5亚型; 禽流感病毒; 血凝素基因; 重组鸡痘病毒; 灭活疫苗 ; 免疫效力
前言：
大面积发生高致病性禽流感( HPAI) 时, 通过疫苗接种建立隔离带是控制疫情的有效措施之一。

例如,在墨西哥和巴基斯坦发生高致病性禽流感时均使用过油乳剂全病毒灭活疫苗辅助疫情控制[1～2]。

灭活疫苗具有效果确实，保护率高、免疫期长和研制周期短等优点[3],但灭活疫苗本身也存在影响疫情监测、散毒风险大、制备成本高等缺陷[4]。

随着禽痘病毒疫苗载体发展的日益完善,使开发克服HPA灭活疫苗缺陷的新型疫苗成为可能。

利用表达高致病性禽流感病毒(HPAIV)血凝素基因( HA )的重组鸡痘病毒免疫SP鸡,可抵抗同亚型HPAIV的攻击,保护期长达20周以上,显示了良好的应用前景[5～7]。

但迄今为止,高致病性禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗在商品鸡的保护效力鲜见报道。

本研究利用表达H5亚型禽流感病毒 HA基因的重组鸡痘病毒和灭活疫苗免疫商品鸡,比较两种疫苗的免疫效力,旨在探讨重组鸡痘病毒疫苗实际应用的可能性,为HPAI的防制提供新的疫苗储备。

1．材料与方法
1. 1毒株
H5N1亚型禽流感病毒鹅源分离株( G 5),为攻毒用毒株; 鸡痘病毒282E疫苗株(FPV282E4)，购自中国兽药监察所,为野生型鸡痘病毒对照。

1. 2 疫苗
表达H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒(rFPVHA ),贾立军等构建，H5亚型禽流感油乳剂全病毒灭活疫苗,按常规方法制备。

1. 3 试验动物
1日龄无母源抗体的商品代罗曼蛋鸡: 其父母代种鸡未经鸡痘疫苗和H5亚型禽流感疫苗免疫。

1日龄含母源抗体的商品代罗曼蛋鸡:种鸡在2～3周龄时分别进行鸡痘疫苗和H5亚型禽流感灭活疫苗免疫,17～18周龄时分别加强免疫1次,其子代1日龄雏鸡H5亚型禽流感病毒HI 抗体呈阳性。

以上商品鸡分别购自集约化养殖场。

1. 4疫苗在1日龄无母源抗体商品鸡的免疫效力
99只1日龄无母源抗体的商品鸡随机分为5组,每组19～20只。

分别以106PFU 和103PFUrF-PV-HA，0.2mL灭活疫苗，106PFU FPV28 2E4和0.2mLPBS经颈部皮下接种。

接种后22d用104ELD5的G5经肌肉注射攻毒,观察15d ,统计发病和死亡情况。

在免疫后第10、14、18和22天采血,检测血清HI抗体效价。

1. 5 疫苗在1日龄含母源抗体商品鸡的免疫效力
99 只1日龄含母源抗体的商品鸡随机分为5组,每组19～20只。

1日龄时随机采集10份雏鸡血清样品,测母源抗体效价。

其他处理同1 . 4。

1.6 血清学检测
血凝试验( HA 试验)和血凝抑制试验(H试验)待检血清H I抗体滴度大于或等于4log2时判为阳性。

1.7保护率计算
保护率= [(攻毒对照组死亡率- 疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率]100%。

1.8统计分析
采用 SPSS统计分析软件进行数据处理,对HI抗体应答阳性率，攻毒后各组鸡只发病率和死亡率进行卡方检验。

2
2．结果
2.1 rFPV-HA和灭活疫苗诱导的HI抗体应答
用106PFU和103PFU rFPV-HA 免疫无母源抗体雏鸡,免疫后14，18和22dHI 抗体阳性率分别为7% ，7% 、13.3%～40%;灭活疫苗免疫组同期的HI抗体阳性率分别为13.3% ，40%和73.3% ,均高于rFPV-HA免疫组,但统计学差异不显著(P> 0.05)，见表1.
1日龄含母源抗体雏鸡HI抗体阳性率为50%。

(5/10),平均滴度为4.4log2;至14d时,HI抗体消失。

免疫后22d,rFPV-HA免疫组HI抗体均为阴性。

灭活疫苗免疫组在18d和22d HI抗体阳性率分别为6.7%和26.7 %。

（表1）
表1 雏鸡免疫后的HI 抗体应答
3
2.2 rFPV-HA与灭活疫苗的免疫效力
对于无母源抗体商品鸡,106PFU和103PFU，rF-PV-HA免疫组均抵御G5的致死性攻击,保护率为100 % ;灭活疫苗保护率为94.7% 。

FPV 282E4对照组和
攻毒对照组从攻毒后第2天开始发病,并于攻毒后 2～7d内100%死亡,死亡高
峰为攻毒后3～5d。

（表2）
对于含母源抗体的商品鸡,103PFU和106PFU，rFPV-HA免疫组在攻毒后发病率分别为80%和89.5%,死亡率为80%和84.2%,保护率为15.8%和11.4%。

灭活疫苗免疫组45%发病,30%死亡,保护率为68.4% ,明显高于rFPV-HA免疫组。

免疫组和对照组部分鸡只从攻毒后4d起发病,并于攻毒后4～15d内死亡,死亡高峰为攻毒后4～8d(表2)
表2 攻毒后鸡只发病死亡情况
4
3. 讨论
3. 1 rFPV-HA 与灭活疫苗诱导HI 抗体应答能力
rF PV -HA 与灭活疫苗免疫无母源抗体商品鸡,HI抗体最早检出时间均在免疫后 14d。

但在整个检测期内,灭活疫苗免疫组HI抗体应答阳性率均高于
重组病毒免疫组,表明灭活疫苗能更有效地诱导HI抗体应答,但HI抗体阳性率和平均抗体滴度无显著差异(P>0.05) 。

rFPV-HA免疫含母源抗体商品鸡22d后,HI抗体呈阴性,表明针对鸡痘病毒和H5 亚型禽流感病毒的母源抗体完全抑制了HI抗体应答。

与之类似,灭活疫苗
免疫含母源抗体商品鸡后,HI抗体产生时间推迟,应答水平明显降低,表明也受
到了H5亚型流感病毒母源抗体的干扰。

3.2 rFPV-HA与油乳剂灭活疫苗免疫效力比较
rFPV-HA和灭活疫苗免疫SPF鸡保护率均为100%对于无母源抗体的商品鸡, rFPV-HA免疫效果(100%)也完全达到灭活疫苗的保护水平(94.7% ),提示rFPV -HA在实际应用中可对无母源抗体的商品鸡提供良好保护。

对于1日龄含母源抗体的商品鸡,rFPV-HA诱导的保护率仅为11.4%～15.8% , 表明母源抗体严重抑制rFPV-HA主动免疫;灭活疫苗保护率为68.4%,提示灭活疫苗克服母源抗体的能力强于rFPV-HA.。

但与无母源抗体的商品鸡比较,灭活疫苗免疫组仍45%发病,约30%死亡。

rFPV-HA和灭活疫苗均受到母源抗体
的严重干扰, 提示实际应用中需待母源抗体消失或降低到一定水平后再进行
免疫。

另一项研究表明,利用rFPV-HA免疫同时存在鸡痘病毒母源抗体和H5亚型母源抗体的商品鸡,在经口腔和鼻腔攻毒后,1日龄免疫的保护率为90%,14天时
免疫诱导的保护率为100%，而灭活疫苗1日龄免疫的保护率为70%(数据未附),
提示利用自然感染途径进行攻毒时,rFPV-HA免疫组的保护率高于肌肉途径攻
毒免疫组。

3 .3 rFPV-HA 与油乳剂灭活疫苗应用前景分析
与灭活疫苗比较,rFPV-HA具有以下优点:rFPV-HA免疫不影响疫情监测。

应用灭活疫苗免疫,除诱导针对HA蛋白的抗体,还会产生针对流感病毒型特异性抗原( 基质蛋白和核蛋白)的抗体，影响运用检测这些抗体的血清学方法进行疫情监测,无法区分免疫群和HPAIV自然感染群。

而rFPV-HA仅表达HA蛋白,不诱导针对型特异性抗原的抗体，不影响疫情监测。

rFPV-HA具有高度的安全性。

制备灭活疫苗需大量扩增HPAIV作为免疫原,存在散毒的危险。

尤其在高致病性禽流感疫苗生产管理尚不十分规范的情况下, 更是如此。

生产rFPV-HA疫苗不接触HPAIV,不存在散播HPAIV的风险。

而且构建重组病毒用亲本鸡痘病毒为疫苗株,具有高度的安全性。

成本低廉。

灭活疫苗须用SPF鸡胚扩增病毒,由于HPAIV的高致病性,鸡胚在接种后很快死亡,病毒扩增滴度低。

在随后灭活过程中,尤其使用甲醛做灭活剂,容易使HA蛋白遭到破坏, 进一步降低免疫原滴度, 导致疫苗成本升高。

而利用鸡胚成纤维细胞扩增重7～108PFU/mL ,组鸡痘病毒疫苗时,滴度可达到10相当于本研究最低有效剂量 (103PFU)104～105倍,这为制备价格低廉的重组鸡痘病毒疫苗提供了可能。

免疫应激小,不影响肉品品质。

灭活疫苗使用矿物油佐剂,会引起局部组织炎性损伤和坏死,免疫应激大。

同时矿物油佐剂会造成肉品烃类化合物污染,影响肉品品质,进一步限制了灭活疫苗在肉鸡的应用。

而rFPV-HA不存在上述缺陷,在蛋用鸡和肉用鸡均可使用。

综上所述,rFPV-HA免SPF鸡，无母源抗体的商品鸡,可诱导良好保护,保护效力达到传统灭活疫苗水平。

而且,rFPV-HA具有不影响流感疫情监测，制备和使用安全，成本低廉和免疫应激小等优点, 有望代替或者与灭活疫苗互补应用于HPAI的防制。

6
谢辞
大学四年的学习阶段伴随着论文的完成就要结束了，在这里我要向所有关心、帮助我的老师、同学和朋友致以衷心的感谢！同时，要感谢在大学期间所有给我知识的老师，是你们的悉心教导使我有了良好的专业课知识，这也是论文得以完成的基础。

感谢我的毕业设计指导老师王惠林老师和各科目老师在大学期间给与我的悉心指导和关怀！他们求学的严谨态度、孜孜不倦的探索精神，令我受益终生。

他们对知识地渴求，对生活的乐观，还有他们永远洋溢着笑容的脸庞，也将永远铭刻在我的心中，并激励我奋发向前！
最后向论文评阅人和答辩委员会全体专家老师们表示诚挚的感谢。

7
参考文献：
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8。